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一、稱(chēng)樣
（1）一般稱(chēng)量25g，由于稱(chēng)樣量較大，標準中對于稱(chēng)樣的準確性未作出明確規定，微生物室常用稱(chēng)樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實(shí)際稱(chēng)樣時(shí)可根據樣品情況稱(chēng)取超出25g（如硬質(zhì)糖果等，檢驗人員應依據樣品實(shí)際情況決定如何稱(chēng)樣）；
（2）對于部分食品添加劑已明確須稱(chēng)取1.0g的，則須嚴格精確稱(chēng)量。
二、樣品稀釋
（1）固體或半固體：稱(chēng)取25g樣品于均質(zhì)袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點(diǎn)/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min，此時(shí)即制備成1：10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復吹打2次，此時(shí)即制備成1：100的勻液，以此類(lèi)推，制備10倍系列稀釋勻液。
（2）液體樣品：直接吸取原液進(jìn)行檢驗，稀釋時(shí)可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。
三、稀釋度的選取
液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗；固體或半固體則必須依據檢驗經(jīng)驗，選取2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行檢驗（一般樣品選取1：10，1：100，1：1000三個(gè)稀釋度進(jìn)行檢驗。若遇到不常做的樣品，可適當延長(cháng)稀釋度至1：100000甚至1：1000000）。
四、質(zhì)量控制
空白對照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。（若空白有菌落生長(cháng)則該實(shí)驗無(wú)效）。
五、平板計數瓊脂（PCA）
滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。
六、
有時(shí)樣品基質(zhì)比較特殊，樣品勻液有細小的顆粒與菌落不易區分，此時(shí)可采用如下方法進(jìn)行區分：
（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱(chēng)紅四唑或紅四氮唑，簡(jiǎn)稱(chēng)TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；
（2）待PCA瓊脂培養基冷卻至適宜傾注溫度時(shí)，無(wú)菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時(shí)PCA中TTC濃度為0.005%）。
加入TTC的目的及注意事項：培養后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計數；PCA中TTC的濃度不宜過(guò)高，否則會(huì )抑制微生物的生長(cháng)，對實(shí)驗結果產(chǎn)生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規實(shí)驗無(wú)須添加，特別是對于菌落數量較少的樣品不宜添加。方法來(lái)源依據為《化妝品衛生規范》中菌落總數測定相關(guān)章節）
七、稀釋液
常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。
八、
傾注培養基時(shí)，根據對樣品污染情況的估計（同一類(lèi)型樣品的微生物檢測經(jīng)驗），若樣品有表面蔓延生長(cháng)的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數。
九、
水產(chǎn)品30±1℃培養72±3h；其它樣品36±1℃培養48±2h。注意：此處的“水產(chǎn)品”是指生魚(yú)片、魷魚(yú)干等未經(jīng)深度加工的水產(chǎn)品。
十、
本標準的重難點(diǎn)為菌落計數及計算。除標準中已說(shuō)明的要求外，有以下幾點(diǎn)需要注意：
（1）菌落計數時(shí)，從低稀釋度的平板開(kāi)始計數。若所有平板上的菌落數均小于30CFU，則須計數所有平板上的菌落數，但僅采用最接近30CFU的兩個(gè)平板的菌落數來(lái)計算最終菌落總數。
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過(guò)程及結果修約如下：
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算過(guò)程 |
修約后結果 |
|
|
1:10 |
27 |
28 |
27.5 |
（（27+28）/2）*10=275 |
280CFU/g |
|
1:100 |
3 |
4 |
3.5 |
280CFU/g |
|
|
1:1000 |
0 |
0 |
0 |
280CFU/g |
|
（2）當第一稀釋梯度一個(gè)板上菌落數高于30，另一個(gè)低于30，則依據標準應當以介于30-300之間的菌落數作為該稀釋梯度的菌落數。（存在爭議，實(shí)際遇到該類(lèi)情況時(shí)應謹慎對待）
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過(guò)程及結果修約如下：
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算結果 |
修約后結果 |
|
|
1:10 |
37 |
28 |
32.5 |
37*10=370 |
370CFU/g |
|
1:100 |
3 |
4 |
3.5 |
370CFU/g |
|
|
1:1000 |
0 |
0 |
0 |
370CFU/g |
|
（3）若所有平板上的菌落數均大于30CFU，則只計數30-300CFU之間的平板上的菌落數，并采用這些數據，依據標準中給定的公式，進(jìn)行最終菌落總數的計算，此時(shí)將大于300CFU的記為“多不可計”，以“TNTC”表示。
以固體樣品舉例，根據標準中給定的公示，菌落數選取、計算過(guò)程及結果修約如下：
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算結果 |
修約后結果 |
|
|
1:10 |
TNTC |
TNTC |
/ |
（245+246+31）/（（2+1*0.1））=24857 |
25000CFU/g |
|
1:100 |
245 |
246 |
245.5 |
25000CFU/g |
|
|
1:1000 |
28 |
31 |
29.5 |
25000CFU/g |
|
（4）若所有稀釋度的平板菌落數都大于300，則不能所有都計為T(mén)NTC，必須將最高稀釋度的兩個(gè)平板上的菌落逐一地計數，再計算平均數，該平均數為該梯度的菌落總數，其余平板上的菌落數可記為T(mén)NTC。
以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過(guò)程及結果修約如下：
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算結果 |
修約后結果 |
|
|
1:10 |
TNTC |
TNTC |
/ |
（（312+301）/2）*10=306500 |
31000CFU/g |
|
1:100 |
TNTC |
TNTC |
/ |
31000CFU/g |
|
|
1:1000 |
312 |
301 |
306.5 |
31000CFU/g |
|
（5）計算菌落總數時(shí)，須嚴格按照標準要求進(jìn)行計算。
特殊情況：
①若所有平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數�！白畹拖♂尡稊怠辈⒉皇枪潭ú蛔兊�，與檢驗人員選取的稀釋度有關(guān)。如：某樣品多次檢驗后發(fā)現菌落總數較高，檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無(wú)菌落生長(cháng)，則計算過(guò)程為＜1×1000，最終結果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板，均無(wú)菌落生長(cháng)，則最終結果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對于結果存在較大影響，選擇時(shí)應謹慎。
②最低稀釋度兩個(gè)平板只有一個(gè)平板上長(cháng)了1個(gè)菌落，若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數為1:10，此時(shí)計算過(guò)程為（1+0）/2×10=5，由于默認固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗的菌落總數結果為10CFU。注意：對于該情況一直存在爭議，不同的檢驗人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無(wú)固定做法。（建議檢驗人員保持一貫做法，不要隨意更改）
舉例如下：
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算結果 |
修約后結果 |
||
|
原液 |
1 |
0 |
0.5 |
0.5 |
1CFU/ml |
|
|
1:10 |
0 |
0 |
0 |
1CFU/ml |
||
|
稀釋度 |
菌落數 |
平均數 |
計算結果 |
修約后結果 |
||
|
1:10 |
1 |
0 |
0.5 |
0.5 |
5/10CFU/ml |
|
|
1:100 |
0 |
0 |
0 |
5/10CFU/ml |
||
十一、
對于水產(chǎn)品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數含量較高、限量值較大的食品類(lèi)別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導致培養后平板上菌落蔓延、彌散而難以計數甚至無(wú)法計數。
本文轉載自微信公眾號食品微生物檢測。
上一篇：培養基的質(zhì)量控制
