培養基的質(zhì)量控制

1.證明文件

  1.1生產(chǎn)企業(yè)提供的文件生產(chǎn)企業(yè)應提供下列材料：

  一一培養基、獨立成分、添加劑的名稱(chēng)及產(chǎn)品編碼；

  一一批號；

  一一培養基的最終pH；

  一一儲藏信息和有效期；

  一一質(zhì)控證書(shū)和所用的測試菌株；

  一一性能測試的結果與驗收標準；

  一一技術(shù)數據清單；

  一一必要的安全/危害數據。

  1.2產(chǎn)品的交付驗收

  對每一批產(chǎn)品（成分或培養基），均應檢查：

  一一產(chǎn)品的標識；

  一一包裝完整性；

  一一產(chǎn)品的有效期；

  一一支持性文件。

  記錄產(chǎn)品的接收日期。

2.貯存

  2.1總則

  應嚴格按照供應商提供的貯存條件、有效期和使用方法進(jìn)行培養基的保存和使用。

  2.2脫水培養基及其添加劑的質(zhì)量管理和質(zhì)量控制

  新購買(mǎi)的培養基一般為脫水的粉狀或顆粒狀，保存在密閉的容器中。用于菌種選擇或鑒定的添加成分通常為凍干物或液體。培養基的購買(mǎi)應有計劃，以有利于存貨的周轉（即掌握先購先用的原則）。實(shí)驗室應保存有效的培養基目錄清單，清單應包括以下內容：

  一一容器密閉性檢查；

  一一首次開(kāi)封日期；

  一一內容物的感官評價(jià)。

  對于新開(kāi)封的培養基，應對其質(zhì)量進(jìn)行檢查。通過(guò)粉末的流動(dòng)性、均勻性、結塊情況和色澤變化等判斷培養基質(zhì)量的變化。若發(fā)現培養基受潮或物理形狀發(fā)生明顯改變則應廢棄。

  2.3商品化即用型培養基

  應嚴格按照供應商提供的貯存條件、有效期和使用方法進(jìn)行培養基的保存和使用。

  2.4實(shí)驗室制備的培養基

  培養基的保質(zhì)期各不相同。不同的標準中均有明確規定了保存的條件和保質(zhì)期。培養基應保存在防止其成分發(fā)生變化的環(huán)境下，即應避光、干燥保存；如有必要，用保存于2℃～8℃冰箱中，或依據培養基要求的儲存條件進(jìn)行保存。除標準規定或保質(zhì)期驗證實(shí)驗的結果表明有較長(cháng)的保質(zhì)期外，通常平板保存不超過(guò)2周～4周，三角瓶和試管的保存不超過(guò)3個(gè)月～6個(gè)月。除標準規定或保質(zhì)期驗證實(shí)驗的結果表明有較長(cháng)的保質(zhì)期外，含有不穩定添加成分的培養基應即配即用。對發(fā)生化學(xué)反應或含有不穩定物質(zhì)的固體培養基也應即配即用，不可二次融化。

  實(shí)驗室應對貯存培養基的有效期進(jìn)行規定。觀(guān)察培養基顏色變化，是否有蒸發(fā)/脫水情況，是否有微生物生長(cháng)。當培養基發(fā)生這類(lèi)變化時(shí)，應停止使用。在使用和進(jìn)一步加熱前，應事先將培養基放置到室溫。

3.培養基的實(shí)驗室制備

  3.1總則

  正確制備培養基是微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)（如膽鹽或其他選擇劑）的成分時(shí)，應遵守良好實(shí)驗室規范和生產(chǎn)廠(chǎng)商提供的使用說(shuō)明。培養基的不正確制備會(huì )導致培養基出現質(zhì)量問(wèn)題。

  使用商品化脫水合成培養基制備培養基時(shí)，應嚴格按照廠(chǎng)商提供的使用說(shuō)明配置。記錄所有相關(guān)數據，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。

  使用各別成分制備培養基時(shí)，應按照配方準確配制，記錄所有細節信息，如：培養基名稱(chēng)和類(lèi)型及試劑級別、每個(gè)成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養基體積（分裝體積）、無(wú)菌措施（包括實(shí)施的方式、溫度及時(shí)間）、配置日期、人員等，以便溯源。

  3.2水

  除特定要求，實(shí)驗室用水的電導率在25℃下應不高于25μS/cm （相當于電阻率注0.4MΩcm)。

  微生物污染應不超過(guò)103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。

  3.3稱(chēng)量和復水

  稱(chēng)量所需量的脫水培養基（注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養基粉末），先加入少量水，充分混合（莊意避免培養基結塊）后再加水至所需的量。

  3.4溶解和分裝

  脫水培養基加水后適當加熱，并不停攪拌使其快速溶解，必要時(shí)，重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。

  3.5pH的測定和調整

  用pH計測定pH，必要時(shí)在滅菌前調節pH，除特殊說(shuō)明外，培養基滅菌后冷卻至25℃時(shí)，要求pH的變化不超過(guò)0.2pH單位。通常使用濃度約為40g/L（約1mol/L）的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L）的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌后調節pH，溶液需滅菌。

  注：商品化培養基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化，但使用蒸餾水或去離子水時(shí)，滅菌前無(wú)需調節pH。

  3.6分裝

  將配置好的培養基分裝到適當的容器中，容器的體積至少為培養基體積的1.2倍。

  3.7滅菌

   3.7.1概述

   培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌（3.7.2）或過(guò)濾滅菌（3.7.3）。

   有些培養基無(wú)需高壓滅菌，可煮沸滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感，應在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需滅菌，直接使用（參見(jiàn)相關(guān)標準或生產(chǎn)廠(chǎng)商的使用說(shuō)明）。

   3.7.2濕熱滅菌

   濕熱滅菌在高壓鍋或培養基制備器中進(jìn)行。高壓滅菌一般采用121℃±3℃滅菌15min。如果培養基的體積超過(guò)1000mL，要對滅菌條件進(jìn)行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說(shuō)明的規定進(jìn)行。

   注：大容量培養基（＞1000mL）滅菌時(shí)可能會(huì )造成過(guò)度加熱。

   加熱后應采取適當的方式冷卻，防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基（如含亮綠的培養基）是非常重要的。

   3.7.3過(guò)濾災菌

   過(guò)濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進(jìn)行。使用無(wú)菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過(guò)濾裝置的各個(gè)部分消毒滅菌，或使用預消毒設備。

一些濾膜上附著(zhù)蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)（如抗生素）。為達到有效過(guò)濾，應事先將濾膜用無(wú)菌水潤濕。

   3.7.4監測

   應對經(jīng)濕熱或過(guò)濾滅菌的培養基進(jìn)行監測，尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進(jìn)行監測。

  3.8添加劑的制備

  制備含有有毒物質(zhì)（特別是抗生素）的添加成分時(shí)，應小心操作，避免因粉末的擴散造成實(shí)驗人員過(guò)敏或發(fā)生其他不良反應。采用適當的預防措施并小心按照產(chǎn)品使用說(shuō)明操作。不要使用過(guò)期的試劑；抗生素工作溶液現配現用；批量配置的抗生素溶液分裝后可冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍；廠(chǎng)商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關(guān)資料，也可由使用者自行測定。

4.培養基的使用

  4.1瓊脂培養基的融化

  將培養基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法（如高壓鍋中的蒸汽）融化。經(jīng)過(guò)高壓滅菌的培養基盡量減少重新加熱的時(shí)間，避免過(guò)度加熱。培養基融化后立即移開(kāi)，室溫靜置片刻（約2min)，以免玻璃容器發(fā)生破裂。

  融化后的培養基放人47℃～50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃～50℃所需的時(shí)間取決于培養基的類(lèi)型、體積和在水在鍋里的分裝量。融化后的培養基應盡快使用，放置時(shí)間一般不超過(guò)4h。剩余的培養基凝固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養基，應根據相關(guān)標準，縮短融化后放置的時(shí)間。

  將瓊脂培養基倒人類(lèi)似檢測培養基使用的獨立容器中，插入溫度計，記錄并保存瓊脂的融化、溫度。加入樣品的培養基應將溫度調節到44℃～47℃，或按照相關(guān)標準調節溫度。

  4.2培養基的脫氣

  必要時(shí)，在使用前將培養基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min，加熱時(shí)松開(kāi)容器蓋子；加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。

  4.3添加成分的加入

  對熱不穩定的添加成分應在培養基冷卻至47℃~50℃時(shí)加人。滅菌的添加成分加入前應冷卻至室溫，避免冷的液體會(huì )造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分緩慢加入培養基并充分棍勻，盡快分裝到待用的容器中。

  4.4平板的制備和儲存

  傾注融化后的培養基到平皿中，使之在乎皿中形成一個(gè)至少3mm厚度的瓊脂層（直徑90mm的平皿通常要加入18mL～20mL瓊脂培養基），或根據相關(guān)標準要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使瓊脂冷卻凝固。如果平板要儲存、培養時(shí)間超過(guò)48h或培養溫度超過(guò)40℃，要增加培養基的傾注量。

  注：在培養過(guò)程中，瓊脂培養基會(huì )損失水分，在某些環(huán)撓條件下會(huì )影響微生物的生長(cháng)。造成培養基水分損失的因素很多，如培養基的成分、平皿中培養基的量、培養箱的類(lèi)型（如使用帶鳳扇的培養箱）、培養箱里的空氣濕度、平皿在培養箱中放置的位置和數量以及培養溫度等。

  凝固后的培養基應立即使用或存放在防止其成分發(fā)生變化的條件下，如存放于暗處和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中（見(jiàn)4.2）。在平板的底部或側面做好標記，標記的內容包括培養基名稱(chēng)、制備日期和（或）有效期。也可使用適宜的培養基編碼系統進(jìn)行標記。

  將傾注好的平板放在密封袋中冷藏可延長(cháng)儲存期限。為了避免冷凝水的產(chǎn)生，平板應冷卻后再裝人密封袋中。貯存前不要對培養基表面進(jìn)行干燥處理。

  對于采用表面接種的固體培養基，應先對瓊脂表面進(jìn)行干燥：揭開(kāi)平皿蓋，將平板倒扣于烘箱／培養箱中（溫度設置為25℃～50℃）；或放在有對流風(fēng)的無(wú)菌凈化臺中，直到培養基表面的水滴消失為止。注意不要過(guò)度干燥。商業(yè)化的平板瓊脂培養基應按照廠(chǎng)商提供的說(shuō)明使用。

  4.5培養基的棄置

  所有污染和未使用的培養基的棄置應采用安全的方式，并符合相關(guān)法律法規的規定。

5.最終培養基的性能測試

  5.1概述

  最低標準參見(jiàn)5.2和5.3；實(shí)際上，食物和水中可能含有應激微生物。培養基對應激微生物復蘇的反應的適應性應考慮在內。

  5.2物理質(zhì)量控制

  見(jiàn)下一篇。

  5.3微生物質(zhì)量控制

   5.3.1污染的控制

   從每批制備好的培養基中選取適量進(jìn)行污染測試。

   5.3.2測試菌株

   測試菌株是具有其代表種的穩定特性并能有效證明實(shí)驗室特定培養基最佳性能的一套菌株。測試菌株主要購置于標準菌株保藏中心，也可是實(shí)驗室自己分離的具有良好特性的菌株。實(shí)驗室應檢測和記錄標準儲備菌株的菌株特性，新復蘇的菌株可能會(huì )有非特異性反應，使用時(shí)應引起注意；最好使用從食物或水中分離得到的菌株。

   每種培養基的測試菌株應包括：

   一一具有典型反應特性的強陽(yáng)性菌株；

   一一弱陽(yáng)性菌株（如對培養基中選擇劑等試劑敏感性強的菌株）；

   一一顯示陰性特性的菌株；

   一一部分或完全抑制菌株。

   5.3.3即用型培養基和試劑

   商業(yè)化即用型培養基的生產(chǎn)商如果通過(guò)ISO9000體系認證，應在適當位置有質(zhì)量聲明并提供培養基的品質(zhì)證書(shū)。這樣，使用者無(wú)需進(jìn)行大量的培養基測試工作，但應確保貯存條件與廠(chǎng)商推薦的一致。即用型培養基至少要求進(jìn)行定性測試。

   5.3.4商品化脫水合成培養基制備的培養基

   對分離和計數培養基而言，至少應進(jìn)行半定量測試。對于鑒別培養基而言，只需進(jìn)行定性測試。定量測試對培養基的質(zhì)量有更高的保證。

   不含指示劑和選擇劑的培養基，只需用陽(yáng)性測試菌株進(jìn)行檢測。含有指示劑和選擇劑的培養基，應使用能證明其指示和選擇功能的菌株進(jìn)行檢測。復合培養基（即加入添加成分的培養基）應用具有5.3.2列舉的特性的菌株逐批進(jìn)行驗證。

   5.3.5各別成分制備的培養基

   建議除了按照5.3.4中進(jìn)行定性測試外，還應進(jìn)行定量測試以監控基礎材料的質(zhì)量，培養基的生長(cháng)率和實(shí)驗室內部的配制規范。

培養基的質(zhì)量保證一一疑難解答

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