培養基的制備和高壓蒸汽滅菌

   
   一、目的和要求
1 、明確培養基的配制原理，掌握配制培養基的方法和步驟
2、學(xué)習開(kāi)掌握高壓蒸汽滅菌的基本原理及操作方法
3、學(xué)習空器皿的包扎、棉塞的制作等實(shí)驗前準備工作
二、原理
培養基：培養基是人工地將多種營(yíng)養物質(zhì)按照各種微生物生長(cháng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養物質(zhì)，用以培養或分離各種微生物。
牛肉膏蛋白胨培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時(shí)又稱(chēng)為普通培養基，由于這種培養基中含有一般細菌生長(cháng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養物質(zhì)，所以可供作微生物生長(cháng)繁殖之用�；�礎培養基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無(wú)機鹽。由于這種培養基多用于培養細菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長(cháng)繁殖。
按照培養基的物理狀態(tài)，可將培養基分為：固體培養基、半固體培養基、液體培養基。
在液體培養基中加入凝固劑，如瓊脂、明膠、硅膠等，即為固體培養基。以瓊脂為例，一般固體培養基中，加入1.5%-2.0%。
在液體培養基中加入少量凝固劑即為半固體培養基。一般瓊脂只需要加入0.2%-0.7%。
已經(jīng)配制好的培養基必須立即滅菌，以防止其中的微生物生長(cháng)而消耗營(yíng)養成分和改變培養基的pH。
高壓蒸汽滅菌：
是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表Ⅵ-2），二是濕熱的穿透力比干熱大（表Ⅵ-3）；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2．26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
三、具體操作：
培養基的配制方法和步驟及注意事項
1.先在空燒瓶中加入所要配制總量的50%左右的水（合成培養基）。
2、稱(chēng)量：
▲未稱(chēng)的藥品與稱(chēng)過(guò)的藥品要分開(kāi)來(lái)
▲藥勺用完要洗干凈放回原處，一種試劑用一把勺
▲按照配方正確稱(chēng)取各種原料放于燒杯中。若是合成培養基，各成份要逐一溶解。
▲稱(chēng)不溶性固形物時(shí)，應單獨稱(chēng)，若量少的可以與無(wú)機鹽一起稱(chēng)，但一定要混勻再分裝。
3、溶化：
▲玻棒攪勻，加熱溶解，最后定容
▲定容：可先加少量水溶解，倒入量筒，再補水到刻度
▲一般情況下培養基用自來(lái)水配制。
4、調pH值：用1N NaOH或1N HCl調pH，用pH試紙對照。不可反復調pH，否則會(huì )影響培養基的滲透壓。
5、加瓊脂粉：分裝過(guò)程中要不斷攪拌，以使每管的瓊脂粉都能均勻。
6、分裝：試管總長(cháng)的1/4，三角瓶的1/2（裝量指固體培養基）。注意不要污染棉塞、試管口。
7、              包扎：試管和三角燒瓶分別塞上棉塞并包上牛皮紙，包扎成捆，注明何種培養基、時(shí)間。
8、              滅菌備用：
▲培養基不能反復高溫滅菌，否則會(huì )破壞其中的營(yíng)養成分。
▲培養基滅菌后必須在35-370C下恒溫培養24h，確定無(wú)菌生長(cháng)，方可使用。
高壓蒸汽滅菌步驟及注意點(diǎn)：
1．首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水。
2．放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。
3．加蓋，以?xún)蓛蓪ΨQ(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓。
4．水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥。
5、當鍋內壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗用 1．05kg/cm2，121．3℃，20分鐘滅菌。
5．滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，
 6．將取出的滅菌培養基放入 37℃溫箱培養24小時(shí)，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(cháng)，即可待用。

 

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