常見(jiàn)微生物菌種衰退原因及預防

  微生物長(cháng)期受到外界的影響，遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進(jìn)化。然而由于突變的存在，菌種在培養或保藏過(guò)程中，可能會(huì )出現某些優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標記丟失、典型特征改變等現象，稱(chēng)為菌種衰退。比如蘇云金芽孢桿菌由于菌種衰退，導致其新生的菌體芽孢和伴孢晶體都比較��；保藏的沙門(mén)氏菌鞭毛抗原丟失，導致H多價(jià)血清不凝固等。

一、菌種衰退原因

  菌種衰退的根本原因是有關(guān)基因的負突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，則表現為產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過(guò)程中會(huì )發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的幾率很低(一般為10-6～10-9)，尤其是對于某一特定基因來(lái)說(shuō)，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著(zhù)傳代次數增加，衰退細胞的數目就會(huì )不斷增加，在數量上逐漸占優(yōu)勢，最終成為一株衰退了的菌株。此外，菌種衰退還有以下幾種原因：

  1、表型延遲造成菌種衰退

  表型延遲現象也會(huì )造成菌種衰退。如，在誘變育種過(guò)程中，經(jīng)常會(huì )發(fā)現某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了。

  2、質(zhì)粒脫落導致菌種衰退

  質(zhì)粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)�？刂频�。當菌株細胞由于自發(fā)突變或外界條件影響(如高溫)，致使控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內DNA和質(zhì)粒復制不一致，即DNA復制速度超過(guò)質(zhì)粒，經(jīng)多次傳代后，某些細胞中就不具有對產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這類(lèi)細胞數量不斷提高達到優(yōu)勢，則菌種表現為衰退。

  3、連續傳代

  連續傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。一方面，傳代次數越多，發(fā)生自發(fā)突變(尤其是負突變)的幾率越高；另一方面，傳代次數越多，群體中個(gè)別的衰退型細胞數量增加并占據優(yōu)勢越快，致使群體表型出現衰退。

  4、不適宜的培養和保藏條件

  不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。不良的培養條件如營(yíng)養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營(yíng)養、含水量、溫度、氧氣等，不僅會(huì )誘發(fā)衰退型細胞的出現，還會(huì )促進(jìn)衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過(guò)正常細胞，造成菌種衰退。

二、防止菌種衰退措施

  采用已衰退菌種進(jìn)行生產(chǎn)會(huì )影響生產(chǎn)效率，而把已衰退菌種作為陽(yáng)性菌株進(jìn)行檢驗，則會(huì )影響檢驗正確率。既然變異是不可避免的，那么我們應該如果避免菌種衰退呢？

  1、控制傳代次數

  盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代減少到最低的水平以減少突變幾率。傳代次數越多，產(chǎn)生突變的幾率就越大，菌種發(fā)生衰退的機會(huì )就越高。在實(shí)驗室檢驗或者是生產(chǎn)實(shí)際中，應嚴格控制傳代次數。中國藥典當中規定，培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過(guò)5代，以防止菌株因傳代次數過(guò)多引起衰退影響檢驗。

  2、利用不同類(lèi)型細胞進(jìn)行接種傳代

  放線(xiàn)菌，霉菌用菌絲進(jìn)行移種比分生孢子容易衰退，因菌絲是對核且有異核存在，所以移種霉菌適宜采用孢子。

  3、良好的培養條件

  不良的培養條件會(huì )衰退細胞的出現，因此采用適宜的培養基進(jìn)行菌種培養，以減少衰退幾率

  4、采用有效的菌種保藏方法

  根據保存時(shí)間的長(cháng)短，選擇適宜的保存方法。

  傳代培養法：復蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養。保藏時(shí)間依微生物種類(lèi)而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個(gè)月轉一次，普通細菌1個(gè)月轉一次，假單胞菌2周轉一次

  甘油凍存法：將復活后經(jīng)過(guò)性能確認的菌株新鮮培養物（一般是第二代菌株），用0.85%的滅菌生理鹽水（約1-2ml）洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管（凍存管）中（如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌液），加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。

  瓷珠保存管保存：菌株保藏管內含特制的小珠（20-25顆）和特殊溶液，只需將培養好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。

瓷珠保存管保存具體操作：

  第一步：對需要保存的菌株進(jìn)行必要的純化，挑取生長(cháng)旺盛時(shí)期的菌落，接入菌株保藏管中，通常需要接入4-7環(huán)，對于苛養菌應多接一些；

  第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；

  第三步：用無(wú)菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；

  第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存（推薦使用-70℃超低溫冰箱）；

  第五步：復蘇時(shí)，只需將小珠在平板上滾動(dòng)或置肉湯中培養。

   本文轉載自微信公眾號食品微生物檢測。

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