微生物擬核的體內和體外染色觀(guān)察

一、目的要求
1 ．學(xué)習并掌握用富爾根氏染色法進(jìn)行體內觀(guān)察微生物擬核的原理和方法．
2 初步了解和掌握提取細菌染色體DNA 及其體外觀(guān)察的方法．
二、墓本原理
富爾根氏（Feulgen）染色法是根據席夫氏（Schiff） 的試劑進(jìn)行的反應而建立的微生物擬核染色法。席夫氏試劑含有堿性復紅和亞硫酸，堿性復紅與亞硫酸結合后，失去醒式結構而變?yōu)闊o(wú)色，當DNA 經(jīng)酸作用而生成的醛化合物與席夫氏試荊結合后，使醒式結構恢復，合成一種帶紫紅色
的堿性復紅衍生物．此染色法對DNA具有特異性，微生物細胞用此法染色后，可在普通光學(xué)顯微鏡下原位觀(guān)察到細胞內擬核的形態(tài)和位置。
富爾根氏染色法主要分兩步：（a）將細胞用1 moL HCL溫和水解．使DNA中的嗦吟堿與戊箱分開(kāi)，放出戊糖的醛基；( b ）放出的戊搪醛基與席夫氏試荊作用后呈紫紅色．
如果將微生物細胞裂解．使其擬核（即染色體DNA ）被抽提出來(lái)，通過(guò)溴化乙錠染色并進(jìn)行瓊脂特凝膠電泳，便可觀(guān)察到釋放到細胞外的染色體DNA . EB 是一種扁平分子染料，可特異性括人DNA 堿基對之間，在紫外線(xiàn)照射下，使DNA 呈現熒光，因而可觀(guān)察到凝膠中的染色體DNA ，由干在提取過(guò)程中大分子染色休DNA 的隨機斷裂，所以經(jīng)凝膠電泳后形成的是一條不整齊的濃的熒光帶（圖IV 一6 ) . 
用EB 染色法進(jìn)行的體外觀(guān)察染色體DNA也分
兩步進(jìn)行：〔 a ）將細胞裂解后抽提染色體DNA ; ( b ）通過(guò)含有EB 的瓊脂精凝膠電泳在紫外光下觀(guān)察染色體DNA熒光棒．
三、器材
1 ．菌種 釀酒酵母，大腸桿菌．
2 溶液或試劑1mol/L HCL2 ％徽酸，Schandiun固定液，亞硫酸水溶液、席夫氏試劑，TE緩沖液，10 % SDS，蛋白酶K ( 20 mg /ml ) , 5 mol/L NaCL，CTAB/NACL,酚／氯仿／異戊醇（25 : 24 : 1 ) , 異丙醇，70 ％乙醇，溴酚藍加樣緩沖液，TAE 電泳緩沖液．
3 儀器或其他用具臺式高速離心機，5 ml塑料離心管，真空干澡器，俄酸燕氣瓶等．
四、操作步驟
l 富爾根氏染色法
( l ）取培養8 一10h 的釀酒酵母涂片，室溫下風(fēng)干
( 2 〕 將涂片置于盛有2 ％鋨酸的蒸氣瓶口上，用俄酸蒸氣固定5min ，然后放入加熱至60℃ 的Schandiun固定液中10min 。
( 3 ）用水沖洗固定后的標本．然后放在60 ℃ 1mol/L HCL中水解8min，水洗．
( 4 ）用席夫氏試荊作用30~40 min , 
( 5 ）由席夫氏試荊中取出放在亞硫酸水溶液中洗5min . 
( 6 ）由亞硫酸水溶液中取出水洗，干燥后，用油鏡觀(guān)察．
2 DNA的抽提和溴化乙錠染色
( l ）取4.5ml大腸桿菌過(guò)夜培養液干5ml塑料離心管中，12 000 r/min 離心1~2 min ，棄上清．
( 2 ）將細胞沉淀懸浮于1 . 7 mlTE 緩沖液中．加入10 %SDS90ul和20mg/ml的蛋白酶K 9 ul ，混勻，37度保溫lh . 
( 3 ）加入5mol/L NaCI 300 ul ，充分混勻，再加入240ulCTAB/NACL，混勻，置65℃ 水浴10 min 。
（4）加入等體積的酚／氯仿/異戊醇〔 25 ：24：l ）混勻，12 O00r ／min 離心5min
（5）將上清水相轉人另一潔凈的塑料離心管中，加0 . 6 倍體積的異丙醇使DNA 沉淀下來(lái)．
（6）快速離心數秒鐘，棄上清，用沁外的乙醇淋洗DNA2次，將DNA沉淀經(jīng)真空干燥后溶于300 ul TE緩沖液中．
用此法獲得的染色體DNA 可用于限制性酶切等分子生物學(xué)操作．
( 7 ）取少量 （約3 ~5ul）提取的DNA樣品（其余置于一20 ℃ 保存），加入3 ul溴酚藍加樣緩沖液，混勻后上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳1~2 h . 
瓊脂鍺中加有EB ．在電泳過(guò)程中，EB 將插人DNA 分子中，
( 8 ）戴上一次性塑料手套（EB 是強誘變劑）將凝膠取出置于紫外分析儀上觀(guān)察染色體DNA 熒光帶． 
五，實(shí)驗報告
1 ．結果
( l ）根據自己的實(shí)驗結果，繪圖表示細胞內核的形態(tài)和位置．
( 2 ）繪圖表示你所觀(guān)察到的瓊脂糖接膠中的染色體DNA 帶。
2 思考題
( l ）大腸桿菌細胞內的染色體是環(huán)形的還是線(xiàn)形的？你從凝膠上觀(guān)察到的體外染色體DNA 應是環(huán)形的還是線(xiàn)形的？為什么？
( 2 ）凝膠上顯現的染色體DNA帶為什么是不整齊的？
   
   

 

上一篇：鞭毛染色法及活細菌運動(dòng)性的觀(guān)察

下一篇：放線(xiàn)菌形態(tài)的觀(guān)察