枯草桿菌黑色變種芽胞懸液的制備方法

  1.以無(wú)菌操作方式開(kāi)啟菌種管，加入適量營(yíng)養肉湯培養基，吹吸數次，使菌種融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL營(yíng)養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。用接種環(huán)取第1代培養的菌懸液，劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂培養基平板上，置36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。挑取上述第2代培養物中典型菌落，接種于營(yíng)養肉湯培養基，置36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h，即為第3代培養物。 

  2.用10.0 mL吸管吸取5.0 mL～10.0 mL第3代～5代的18 h～24 h營(yíng)養肉湯培養物，接種于羅氏瓶（或細胞培養瓶）營(yíng)養瓊脂培養基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿(mǎn)培養基表面，將多余肉湯培養物吸出，羅氏瓶（或細胞培養瓶）置36 ℃±1 ℃恒溫培養箱內培養5 d～7 d。

  3.用接種環(huán)取少許菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接種環(huán)取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通過(guò)火焰加熱將菌固定于玻片上；將涂片放入平皿內，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液，將平皿蓋好，置55 ℃±1 ℃加熱30 min。取出，去濾紙，用自來(lái)水沖去殘留液；加0.5%沙黃水溶液，1 min后水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。在顯微鏡（油鏡）下鏡檢，當芽胞形成率達90%以上時(shí)，即可進(jìn)行以下處理。否則，繼續在室溫下放置一定時(shí)間，直至達到上述芽胞形成率后再進(jìn)行以下處理。

  4.加10.0 mL無(wú)菌蒸餾水于羅氏瓶（或細胞培養瓶）中，以L(fǎng)棒輕輕刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL無(wú)菌蒸餾水沖洗培養基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無(wú)菌錐形燒瓶中，振搖5 min。 

  5.將燒瓶置45 ℃水浴24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽胞。

  6.用無(wú)菌棉花或紗布過(guò)濾芽胞懸液，清除瓊脂凝塊。

  7.將芽胞懸液置無(wú)菌離心管內，以3000 r/min速度離心30 min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，本步驟重復進(jìn)行3遍。

  8.將洗凈的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶?jì)龋?0 ℃水浴10 min（或60 ℃水浴30 min），以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝后冷藏保存備用，有效使用期6個(gè)月。

  9.芽胞懸液在使用時(shí)，先進(jìn)行活菌培養計數。

  10.懷疑有污染時(shí)，以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等方法進(jìn)行鑒定。

  本文節選自中華人民共和國衛生行業(yè)標準《WS/T 683—2020消毒試驗用微生物要求》。

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