鞭毛染色法及活細菌運動(dòng)性的觀(guān)察

一、目的要求
1 ．學(xué)習并初步掌握鞭毛染色法，觀(guān)察細菌鞭毛的形態(tài)特征．
2 ，學(xué)習用壓滴法和懸滴法觀(guān)察細菌的運動(dòng)性，
二、基本原理
鞭毛是細菌的運動(dòng)“器官，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛者生的位里和數目是細茵的一項孟要形態(tài)特征．細菌的椒毛很纖細，其直徑通常為0 . 01 ~0.02um ，所以，除了很少數能形成．毛束（由許多根鞭毛構成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀(guān)察到鞭毛束的存在外，一般細菌的鞭毛均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀(guān)察到，而只能用電子顯微鏡觀(guān)察．要用普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)寮細菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法．
鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色．鞭毛染色方法很多，本實(shí)驗介紹硝酸銀染色法和改良的Uifson 氏染色法，前一種方法更容易掌握．但染色劑配制后保存期較短．
在顯微鏡下觀(guān)察細菌的運動(dòng)性，也可以初步判斷細菌是否有彼毛．細菌運動(dòng)性的觀(guān)察可用壓清法和懸滴法。觀(guān)察時(shí)，要適當減弱光強度以增加反差，若光線(xiàn)太強．細菌和周?chē)�的液體難以區分．
三、器材
1 ．菌種 蘇云金芽孢桿菌，假單胞菌，金黃色花萄球菌．
2 ．染色劑 硝酸銀鞭毛染色液，Leifson氏鞭毛染色液，0.01 ％美藍水溶液．
3 ．儀器或其他用具 載玻片，蓋玻片，凹載玻片，無(wú)菌水，凡士林，顯微鏡等．
四、操作步驟
（一）鞭毛染色
1 ．硝酸銀染色法
( l ）菌種的準備要求用活躍生長(cháng)期菌種作鞭毛染色和運動(dòng)性的觀(guān)察。對于冰箱保存的菌種，通常要連續移種1 一2 次，然后可選用下列方法接種培養作染色用菌種：a取新配制的營(yíng)養瓊脂斜面（表面較濕潤、基部有冷凝水）接種，28 ? 32 ℃ 培養10~14h ，取斜面和冷凝水交接處培養物作染色觀(guān)察材料；杠取新制備的營(yíng)養瓊脂（含0.8~ 1 . 0 ％的瓊脂）平板，用接種環(huán)將新鮮菌種．點(diǎn)種丁平板中央，28 ~32 ℃ 培養18 ～30h ，讓菌種擴散生長(cháng)，取菌落邊緣的菌苔（不要取菌落中央的菌谷）作染色觀(guān)察的菌種材料．
( 2 ）載玻片的準備將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮沸約20 例n ，取出用清水充分洗凈，瀝干水后置95 ％乙醇中，用時(shí)取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。
( 3 ）菌液的制備取斜面或平板菌種培養物數環(huán)于盛有1 一2 劉無(wú)菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片．也可用培養物直接制片，但效果往往不如先制備菌液。挑菌時(shí)，盡可能不帶培養基。
( 4 ）制片取一滴菌液于載玻片的一端，然后將玻片傾斜，便菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多余菌液，室溫｛或37 ℃ 溫室）自然千燥．
干后應盡快染色不宜放，時(shí)間過(guò)長(cháng)，
( 5 ）染色涂片干燥后，滴加硝酸銀染色A 液頂蓋3 一5 min ，用熏餾水充分洗去A 液．用B 液沖去殘水后，冉加B 液夜蓋涂片染色約數秒至l 而n ，當涂面出現明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗，若加B 掖后顯色較慢，可用微火加熱，直至顯揭色時(shí)立即水洗，自然干燥．
配制合格的染色荊（尤其是B 波）、充分洗去A 液再加B 液、水姐好。浪的染色時(shí)聞均丹．毛染色成欣的，．環(huán)節。
( 6 ）鏡檢干后用油鏡觀(guān)察。觀(guān)察時(shí)，可從玻片的一端逐漸移至另一端，有時(shí)只在涂片的一定部位觀(guān)察到鞭毛．
菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色、通常呈波浪形．
2 改良的Leifson氏染色法
( 1 ）載玻片的準備菌種材料的準備同硝酸銀染色法．
( 2 ）制片用記號筆在載玻片反面將玻片分成3 一4 個(gè)等分區，在每一小區的一端放一小滴菌液．將玻片傾斜，讓菌液流到小區的另一端，用濾紙吸去多余的菌液．室溫或37 ℃ 溫室自然千燥．
( 3 ）染色 加Leifson氏染色液覆蓋第一區的涂面，隔數分鐘后，加染液于第二區涂面，如此繼續染第三，四區．間隔時(shí)間自行議定，其目的是為了確定最佳染色時(shí)間．在染色過(guò)程中仔細觀(guān)家，當整個(gè)玻片都出現鐵銹色沉淀、染料表面現出金色膜時(shí)，即直接用水輕輕沖洗（不要先傾去染料再沖洗，否則背景不清）．染色時(shí)間大約10min．自然千燥．
( 4 ）鏡檢干后用油鏡觀(guān)察
菌體和鞭毛均呈紅色．
（二）運動(dòng)性的觀(guān)察
玻片的準備、菌種材料的準備同鞭毛染色法．
1 ．壓滴法
( l ）制片 在潔凈載玻片上加一滴無(wú)菌水，挑取一環(huán)菌液與水棍合，再加一環(huán)0 . 01 ％的美藍水溶液與其混合均勻．用鑷子取一沽凈蓋玻片，使其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片慢怪放下蓋在菌液上．觀(guān)察專(zhuān)性好氧菌時(shí)，可在放蓋玻片時(shí)壓人小氣泡，以防止細菌因缺氧而停止運動(dòng)．( 2 ）鏡檢先用低倍鏡找到標本，再用高倍鏡觀(guān)察。也可用油鏡觀(guān)寮，用油鏡時(shí)，蓋玻片厚度不能超過(guò)017 ? ，觀(guān)察時(shí)，要用略暗光線(xiàn)，
有鞭毛細菌可作直線(xiàn)、波浪式或翻滾運動(dòng)，兩個(gè)細菌之間出現明顯的位移而與布朗運動(dòng)或隨水流動(dòng)相區別．
2 ．懸滴法
（1）涂凡士林取沽凈凹載玻片，在其四周涂少許凡士林
 ( 2 ）加菌液在蓋玻片中央滴一小滴菌液．為便于觀(guān)察時(shí)尋找曲液位t ，可用記號筆在菌液周?chē)��?huà)上記號。菌液不能加得太多，為了便于觀(guān)察，也可用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液于益玻片中央. 
( 3 ）蓋凹玻片將凹玻片的凹槽對準蓋玻片中心的菌液，井輕輕蓋在蓋玻片上．輕輕按壓使蓋玻片與凹玻片粘合在一起，把液摘封閉在小室中。翻轉凹玻片，使菌液滴憊在益玻片下并位于凹槽中央. 
（4） 鏡檢 先用低倍鏡找到標本，并將液滴移至視野中央，然后用高倍鏡觀(guān)察．若用油鏡觀(guān)察，蓋玻片厚度不能超過(guò)O . 17mm , ，并要十分細心，以免壓碎蓋玻片、報壞鏡頭．
五、實(shí)驗報告
l 結果
你所觀(guān)察的3 種細菌是否都有鞭毛？是否都能運動(dòng)？鞭毛― 運動(dòng)有無(wú)相關(guān)性？繪圖表示有鞭毛細菌的形態(tài)特征．
2 ．思考題
( l ）用鞭毛染色法準確鑒定一株紐菌是否具有鞭毛，要注意哪些環(huán)節？
( 2 ) 懸滴法中，為什么要涂凡士林？為什么加的菌液不能大多？如果發(fā)現顯微鏡視野內大量細菌向一個(gè)方向流動(dòng)，你認為是什么原因造成的？
   
   

 

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