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革蘭氏染色是一項經(jīng)典的細菌鑒別手段，自19世紀80年代丹麥的醫師GRAM創(chuàng )立起，至今已經(jīng)近一個(gè)半世紀，仍舊在細菌的檢測和鑒定分類(lèi)上被廣泛應用著(zhù)。在我國，GB 4789系列的國標中很多致病菌的檢測也都需要進(jìn)行革蘭氏染色，可見(jiàn)其重要性。甚至可以說(shuō)沒(méi)有精準掌握革蘭氏染色的微生物檢驗員，不會(huì )是一個(gè)合格的檢驗員。
革蘭氏染色原理
細菌先經(jīng)堿性染料結晶紫染色，而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染后的顏色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類(lèi)，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G-)。為方便進(jìn)一步觀(guān)察，脫色后可再用一種紅色染料如堿性番紅等進(jìn)行復染。陽(yáng)性菌仍帶紫色，陰性菌則被重新染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線(xiàn)菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌、螺旋體和大多數致病性的無(wú)芽孢桿菌都呈現負反應。
細菌細胞通過(guò)結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì )出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
革蘭氏染色法一般步驟
1.涂片固定。在干凈的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液并涂布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數過(guò)多聚集成團，不利于觀(guān)察細菌個(gè)體形態(tài)，可在載玻片一側進(jìn)行上述操作，而在另一側再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋?zhuān)坎汲杀�。若材料為液體培養物或固體培養物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進(jìn)行一次稀釋。
涂片最好在室溫條件下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(cháng)，以防標本烤枯而變形。
標本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個(gè)：(1)殺死微生物，固定細胞結構。(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時(shí)被水沖洗掉。(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端(涂有標本的遠端),標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來(lái)回通過(guò)3-4次，共約2s-3s,并不時(shí)以載玻片背面加熱，載玻片背面觸皮膚，以不覺(jué)過(guò)燙為宜(不超過(guò)60℃),待放置冷后，再進(jìn)行染色。
2.染色。在固定過(guò)的涂片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個(gè)菌膜，染色1min。
3.水洗。染色到一定的時(shí)間，拿住玻片使之成45度角，用細小的水流把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
4.媒染。加碘液覆蓋涂面染1 min。在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。
5.水洗。用細小的水流緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。
6.脫色。加95%酒精數滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20s-30 s后再進(jìn)行水洗，吸去水分。
7.復染。蕃紅染色液染色10 s后， 自來(lái)水沖洗。
8.干燥。染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。
影響染色結果準確性的關(guān)鍵因素：
1.試劑影響。這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實(shí)驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過(guò)期后的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功最基礎的一環(huán)。
2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我們染色過(guò)程中選擇的菌應該是處于活躍生長(cháng)期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結果準確度高，一般情況下不會(huì )出現誤差。培養時(shí)間較長(cháng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會(huì )呈現出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，有人曾經(jīng)統計過(guò)培養至不同時(shí)間的金葡的革蘭氏染色結果，結果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結果的準確率基本可以達到100%，而超過(guò)26h之后，準確率就開(kāi)始下降，培養至36h時(shí)，準確率大概會(huì )下降30%左右。所以我們在染色時(shí)，一定要選擇處于活躍期、活性較強的菌落，在檢測過(guò)程中一定要嚴格的在國標要求的時(shí)間段內進(jìn)行染色試驗，不能提前或者延后。
3.涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過(guò)程中，若是菌體堆積，也會(huì )極大影響染色結果的準確性。菌落堆積過(guò)多，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結果。同時(shí)，在初染、媒染及復染的過(guò)程中，應將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒(méi)有染色。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到最佳效果。
4.媒染時(shí)間。媒染時(shí)間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由于媒染時(shí)間過(guò)長(cháng)，結晶紫在碘液長(cháng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì )導致這種假陽(yáng)性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過(guò)統計，媒染時(shí)間嚴格控制在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到100%，而超過(guò)60s準確率會(huì )有一定的降低，若媒染超過(guò)100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過(guò)程中一定要注意媒染時(shí)間，控制在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是一個(gè)對結果影響較大的操作過(guò)程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌最主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結構，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細菌細胞壁的多糖成分會(huì )被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結晶紫及碘復合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì )被沙黃復染呈紅色；而陽(yáng)性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無(wú)法進(jìn)入，這樣結晶紫和復合物就無(wú)法洗脫出來(lái)使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì )導致陰性菌菌體內的結晶紫和復合物不能有效的全部洗脫出來(lái)，就會(huì )出現明顯的誤差，使陰性菌出現假陽(yáng)性。而洗脫時(shí)間過(guò)長(cháng)，也會(huì )導致陽(yáng)性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內的紫色被洗脫，呈現假陰性。因此洗脫時(shí)間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節。洗脫時(shí)間應當嚴格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。
總結一下，在整個(gè)革蘭氏染色過(guò)程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控制的幾個(gè)方面：染色菌必須是在其活躍期內，涂布狀態(tài)不可太厚，媒染時(shí)間嚴格控制在50s-60s之間，脫色時(shí)間嚴格控制在20s-30s。把握以上的關(guān)鍵控制點(diǎn)，革蘭氏染色基本就不會(huì )出現問(wèn)題啦！
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