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益生菌活菌計數方法現狀
隨著(zhù)益生菌功能研究的深入，益生菌越來(lái)越多地應用于食品和保健食品中，“ 活菌數”是保證其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標。提高益生菌活菌計數方法的準確性和穩定性，可以為企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中對益生菌相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制、提升食品質(zhì)量安全水平提供技術(shù)支撐，同時(shí)可以更好地應用于監管部門(mén)的專(zhuān)項抽查、風(fēng)險監控、執法檢驗等活動(dòng)中。
目前較普遍使用的益生菌活菌計數方法是參照國家標準GB 4789.35-2010《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》。
食品用乳酸菌主要分為兩大類(lèi):一類(lèi)是食品加工用乳酸菌;第二類(lèi)是具有健康功能的活的乳酸菌，又稱(chēng)益生菌。與食品加工用乳酸菌特征指標不同的是，益生菌產(chǎn)品的活菌數通常都很高，可達到100億至1000億以上，而冷凍干燥菌粉原料中活菌數甚至可達到1000億至10000億，且生產(chǎn)日活菌添加量與保質(zhì)期內活菌穩定性通常是益生菌產(chǎn)品最關(guān)鍵的質(zhì)量標準和功效指標，也是衡量益生菌原料與終端產(chǎn)品市場(chǎng)價(jià)值最核心與關(guān)鍵的因素�，F行國標在實(shí)際應用中發(fā)現，進(jìn)行高活菌密度、某些特殊劑型及配方或含有某些新菌種的益生菌產(chǎn)品的活菌計數時(shí)，常常出現結果不穩定或檢驗結果明顯低于生產(chǎn)時(shí)活菌添加量的情況。
影響計數結果最主要的影響因素包括稀釋液和計數培養基。樣品稀釋時(shí)，三個(gè)因素對活菌的準確計數影響最大:稀釋比例、稀釋液組成和pH值。綜述前人的研究經(jīng)驗(2):樣品制備的稀釋比例為1:5-1:10 ;稀釋后樣品懸液的pH值最好與最佳生長(cháng)pH值-致;因益生菌具有氧敏感性,稀釋液中應該含有抗氧化劑。日本研究者M(jìn)asamichi MUTO和Fumiaki ABE等(2010年)在研究了多種稀釋液配方后認為，Mitsuoka' s緩沖液適用于含有嚴格厭氧的雙歧桿菌活菌產(chǎn)品的稀釋?zhuān)摼彌_液含有磷酸鹽、半胱氨酸和吐溫80,前2個(gè)成分分別具有緩沖能力、抗氧化能力，而吐溫80則可改善產(chǎn)品在稀釋液中的分散能力。(3)目前國標方法選用的培養基如下:以MRS瓊脂(厭氧)為總乳酸菌計數培養基;在含有多菌種的產(chǎn)品中，以添加有莫匹羅星抗生素的MRS瓊脂(厭氧)作為雙岐桿菌選擇性計數培養基，以MC瓊脂(需氧)為嗜熱鏈球菌選擇性計數培養基，以總乳酸菌數減去雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌數為乳桿菌數。但是,近年來(lái),綜述多個(gè)研究結果(2, 3)，RCM培養基可提高冷凍干燥雙歧桿菌的活菌計數準確性。
此外，本實(shí)驗室多年來(lái)采用GB 4789 .34-2003《食品衛生微生物學(xué)檢驗雙岐桿菌檢驗》中推薦的TPY瓊脂培養基用于乳酸菌的計數，發(fā)現其用于益生菌產(chǎn)品的活菌計數結果較穩定。
為此，本研究比較了兩種稀釋液及幾種計數培養基對兩類(lèi)代表性益生菌產(chǎn)品(冷凍干燥活菌粉原料和益生菌顆粒產(chǎn)品)活菌計數結果的影響，以確定更符合益生菌產(chǎn)品特點(diǎn)的活菌計數方法。
材料和方法
試劑及培養基
生理鹽水; Mitsuoka' s緩沖液(6.0g Na2HPO, 4.5 g KH2PO,，0.5g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5g吐溫80，1000mL蒸餾水);MRS瓊脂、TPY瓊脂(青島海博) ; RCM瓊脂(OXOID)。改良MRS、改良TPY和改良RCM瓊脂分別為添加有50μg/ml莫匹羅星鋰鹽(青島海博)。
樣品
所用樣品為嗜酸乳桿菌LA11-ONLLY冷凍干燥活菌粉(3000億CFU/g)、長(cháng)雙歧桿菌BL88-ONLLY冷凍干燥活菌粉(3000億CFU/g)和昂立1號益生菌顆粒(國食健字G20060027)產(chǎn)品，均來(lái)自上海交大昂立股份有限公司，各選取三個(gè)批號的樣品進(jìn)行平行檢驗。
實(shí)驗方法
稱(chēng)取2.00g士0.01g樣品，分別至18ml生理鹽水或Mitsuoka' s緩沖液中，均質(zhì)1 min,靜置5 min,分別用生理鹽水或Mitsuoka's緩沖液梯度稀釋至合適濃度。
乳桿菌菌粉計數
以MRS、TPY瓊脂培養基，分別置于37°C厭氧、好氧條件下培養48-72小時(shí)，比較不同稀釋液和培養基對計數結果的影響。
雙歧桿菌菌粉計數
以MRS、TPY和RCM瓊脂培養基，分別置于37°C厭氧培養48-72小時(shí)，比較不同稀釋液和培養基對計數結果的影響。
冷凍干燥活菌粉的計數結果
乳桿菌冷凍干燥菌粉
由于乳桿菌為兼性厭氧菌，在好氧和厭氧條件下均可生長(cháng)，本研究以生理鹽水或Mitsuo-ka’s緩沖液為菌粉稀釋液，以MRS或TPY為培養基,分別在好氧和厭氧進(jìn)行培養。三批嗜酸乳桿菌LAI1-ONLLY菌粉采用不同方法計數的結果見(jiàn)表1和圖1。
從結果看出，培養方式對計數結果影響很小;而稀釋液對計數結果有顯著(zhù)影響。用生理鹽水稀釋和用Mitsuoka's緩沖液稀釋后計數結果分別為3.95×1011cfu/g
和4.47×1011cfu/g，用生理鹽水作為稀釋液可檢出的活菌僅為Mitsuoka' s緩沖液的87%。
雙歧桿菌冷凍干燥菌粉
雙歧桿菌與乳桿菌不同，為嚴格厭氧菌，僅在厭氧條件下生長(cháng)。分別考察兩種稀釋液和三種培養基對長(cháng)雙歧桿菌BL88-ONLLY菌粉計數結果的影響，結果見(jiàn)表2。
從表2結果可見(jiàn)，菌粉稀釋液和培養基均對計數結果產(chǎn)生了顯著(zhù)影響，Mitsuoka' S緩沖液與RCM瓊脂組合檢出的活菌數最高，以此為100%，那么Mitsuoka' s緩沖液與MRS和TPY組合的計數結果分別為36%和98%;而用生理鹽水，MRS、TPY和RCM計數結果僅分別25%、76%和78%，生理鹽水作為稀釋液對活菌細胞影響較大，會(huì )影響計數結果。
益生菌顆粒計數結果
稀釋液對pH值的影響
對昂立1號‘益生菌顆粒連續3個(gè)批號，分別采用生理鹽水和Mitsuoka'S緩沖液溶解并測定pH值，結果見(jiàn)表3。生理鹽水稀釋液pH值為4.41,而Mitsuoka' s緩沖液組的為6.56�？梢�(jiàn)，稀釋液對樣品勻液的pH值影響較大。
益生菌顆�？側樗峋嫈�
采用生理鹽水和Mitsuoka’s緩沖液進(jìn)行樣品稀釋?zhuān)謩e以MRS、TPY和RCM厭氧培養進(jìn)行總乳酸菌計數，結果見(jiàn)表4。Mitsuoka' s緩沖液與RCM組合的計數結果記為100%，則MRS和TPY的結果分別為85%和98%，而用生理鹽水時(shí)三種培養基結果分別為60%、74%和72%，這表明，MRS用于乳桿菌和雙歧桿菌復配產(chǎn)品的總乳酸菌計數時(shí)，結果偏低，Mitsuoka’s緩沖液、TPY和RCM培養基厭氧培養更適用于本產(chǎn)品中總乳酸菌計數。
益生菌顆粒長(cháng)雙歧桿菌選擇性計數
用Mitsuoka' s緩沖液溶解后，以改良MRS、改良TPY和改良RCM厭氧培養，并與國標比較，結果見(jiàn)表5。以改良RCM結果為100%,改良TPY結果為96%左右，而改良MRS結果只有71%左右�？梢�(jiàn)，MRS不適于長(cháng)雙歧桿菌的活菌計數，RCM或TPY更適合。國標方法(生理鹽水/改良MRS培養基)的計數結果僅為59%左右，推薦使用Mitsuoka' S緩沖液、改良TPY或改良RCM培養基厭氧培養進(jìn)行益生菌顆粒產(chǎn)品長(cháng)雙歧桿菌選擇性計數。
益生菌顆粒嗜酸乳桿菌選擇性計數
用國標方法(生理鹽水/ MRS厭氧培養總數減去改良MRS厭氧培養數)、Mitsuoka' s緩沖液/MRS/好氧培養、Mitsuoka' s緩沖液/TPY/好氧培養方法進(jìn)行選擇性計數，結果見(jiàn)表6。以Mitsuoka' S緩沖液/TPY/好氧培養方法計數結果為100%,Mitsuoka' S緩沖液/MRS/好氧培養結果約為95%，而國標方法結果僅為55%。根據本實(shí)驗結果，推薦使用Mitsuoka’s緩沖液、MRS或TPY好氧條件下進(jìn)行益生菌顆粒中嗜酸乳桿菌選擇性計數。
討論
推薦用于冷凍干燥活菌粉的稀釋液和培養基。稀釋液對結果的影響可能是由于高密度菌粉本身呈酸性，若菌粉稀釋液呈酸性，可能會(huì )對細胞造成傷害，而Mitsuoka's緩沖液添加了磷酸鹽作為緩沖體系以及吐溫80作為細胞膜表面活性劑，可以保護細胞在溶解復水過(guò)程中免受損害。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗，推薦Mitsuoka' S緩沖液作為冷凍干燥活菌粉的菌粉和梯度稀釋液;推薦MRS和TPY瓊脂好氧培養用于乳桿菌冷凍干燥活菌粉的計數;推薦TPY和RCM瓊脂厭氧培養用于雙歧桿菌冷凍干燥活菌粉的計數。
推薦用于益生菌產(chǎn)品的稀釋液和培養基。Mitsuoka's緩沖液比生理鹽水更適合用于該活菌產(chǎn)品的稀釋。益生菌顆粒為乳桿菌與雙歧桿菌及其它輔料復配而成的產(chǎn)品。本研究推薦用TPY或RCM在厭氧條件下檢驗總乳酸菌數，采用MRS或TPY在好氧條件下檢驗嗜酸乳桿菌數，采用以莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM在厭氧條件下檢驗長(cháng)雙歧桿菌數。
結論
通過(guò)比較研究，發(fā)現Mitsuoka' s緩沖液更適用于益生菌活菌樣品溶解與梯度稀釋。對乳桿菌活菌粉，推薦采用MRS或TPY于好氧或厭氧條件下計數;對雙歧桿菌活菌粉，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下計數;對乳桿菌和雙歧桿菌混合復配產(chǎn)品，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下進(jìn)行總乳酸菌計數，采用莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM于厭氧條件下進(jìn)行雙歧桿菌選擇性計數，采用MRS或TPY于好氧條件下進(jìn)行嗜酸乳桿菌選擇性計數。
本文轉載自上海交大昂立股份有限公司 張旻 杭曉敏
