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一、瓊脂介紹
瓊脂是由植物中提取的一種多糖，主要來(lái)源于海生藻類(lèi)植物。在微生物培養基中，瓊脂一般只做為凝固劑使用，流體狀培養基中瓊脂的添加量一般為0.5-2g/L（瓊脂使培養基具有一定黏度，阻止液體對流，常用于厭氧菌的培養），半固體培養基中瓊脂的添加量一般為3.5-4g/L（常用于菌種保存、動(dòng)力試驗等），植物組織培養基中瓊脂的添加量一般為5-10g/L，固體培養基中瓊脂的添加量一般為12-15g/L。
瓊脂粉一般為白色、淡黃色或淡灰色粉末狀，在冷水中不溶解，加熱煮沸或高壓滅菌可使瓊脂溶解（多數瓊脂的熔點(diǎn)在90℃左右），冷卻后可凝成固態(tài)（多數瓊脂的凝固點(diǎn)在40℃左右），反復加熱和冷卻雖然可以使瓊脂在液態(tài)和固態(tài)多次轉換，但瓊脂的凝膠強度會(huì )越來(lái)越低。
二、瓊脂培養基的制備和使用方法
（1）按照培養基標簽，稱(chēng)取適量培養基干粉溶解于純化水中，加熱煮沸至瓊脂完全溶解，分裝試管或錐形瓶；
（2）將分裝后的培養基置于規定的條件下進(jìn)行滅菌處理（加熱滅菌的培養基可反復煮沸4-6次至培養基完全溶解，傾入平皿中制成平板使用）；
（3）滅菌結束后，待培養基冷卻至50℃左右，可置于47-50℃水浴保溫（可根據實(shí)際培養基凝固溫度適當提高水浴溫度），放置時(shí)間一般不應超過(guò)4小時(shí)；
（4）臨用前，加入相應的添加劑成分，搖勻后傾入平板，凝固后備用；或制成斜面、傾注使用等。
三、注意事項
（1）溶解干粉時(shí)，建議水溫在40℃以下，最高不超過(guò)60℃。瓊脂在遇到熱水時(shí)，表面易吸水變硬，結成硬塊，不利于分散溶解。因此在進(jìn)行干粉溶解時(shí)，宜用冷水，并不停攪拌至分散均勻無(wú)團塊，再進(jìn)行加熱處理；
（2）滅菌前需進(jìn)行加熱煮沸使瓊脂完全溶解，分散均勻，方可進(jìn)行分裝試管或錐形瓶，否則分裝后可能出現瓊脂分布不均，凝固性不一；滅菌前的加熱煮沸溶解同時(shí)有助于加快高壓滅菌過(guò)程的熱穿透，提高滅菌效果，降低滅菌失敗的幾率；
（3）已凝固的培養基不可以再次高溫高壓滅菌。若培養基內成分較穩定，可重新沸水浴溶化一次使用；
（4）需添加抗生素或其他不穩定成分的培養基，需在臨用前，待培養基冷卻至50-55℃時(shí)加入，過(guò)早或過(guò)熱時(shí)加入這些成分，易導致不穩定成分分解，降低培養基使用效果；
（5）已凝固的培養基不可反復多次加熱溶化使用。反復加熱易使培養基內營(yíng)養成分分解，瓊脂的凝膠強度下降，一般成分較穩定的培養基允許溶化一次使用。
（6）已凝固的培養基，不可在結冰條件下保存。培養基結冰會(huì )使瓊脂內部結構破壞，導致失水或凝固性變差，瓊脂變性。
四、常見(jiàn)問(wèn)題解答
（1）滅菌前培養基沒(méi)有進(jìn)行加熱煮沸溶解，結果發(fā)現滅菌后的培養基制成的平板部分凝固性不好，或瓶?jì)鹊呐囵B基出現分層現象（底層凝固，上層不凝固），是怎么回事？
答：這是由于瓊脂分布不均導致的。瓊脂的比重較大，易下沉至底部，高壓滅菌后雖然從外觀(guān)上看培養基澄清透明，瓊脂已經(jīng)完全溶解，但實(shí)際上瓊脂仍然集中溶解在底部，導致上層含有極少量瓊脂，下層含有大量瓊脂，因此制成的平板會(huì )出現部分不凝固或凝固不完全的現象，瓶?jì)鹊呐囵B基冷卻后出現分層，下層因含大量瓊脂而呈固態(tài)，上層瓊脂少呈液態(tài)。在滅菌前若加熱煮沸使瓊脂完全溶解分布均勻，滅菌后就不會(huì )出現此現象。若滅菌前未進(jìn)行加熱溶解，則滅菌后使用前需充分搖勻，確保溶解在底層的瓊脂均勻分散開(kāi)，也可避免出現平板不凝固或凝固不均勻的問(wèn)題。
此外，偏酸的環(huán)境不利于瓊脂的凝固。因此在制備一些pH偏酸的培養基時(shí)（pH＜4.5），需將瓊脂與其他成分分開(kāi)滅菌，冷卻至50℃左右再混合均勻制成平板。在培養基的制備時(shí)若出現瓊脂不凝固，也有可能是因為配制或滅菌過(guò)程出現問(wèn)題，導致培養基的pH過(guò)低，瓊脂不能凝固。
（2）滅菌后的瓊脂培養基若未用完，可以下次再重新溶化繼續使用嗎？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質(zhì)量要求》標準中指出，“含有活性化學(xué)物質(zhì)或不穩定性成分的固體培養基也應即配即用，不可二次融化”；因此對于一些已添加抗生素、卵黃、血清等不穩定成分的培養基，不可以再次融化使用。而對于一般的培養基，可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培養基融化，再次融化后未用完的培養基則不能重新凝固留待下次使用。
（3）已經(jīng)制備好的固體培養基平板，可以保存多久使用？應如何保存？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質(zhì)量要求》標準中指出，“在保證其成分不會(huì )改變條件下保存，即避光、干燥保存，必要時(shí)在5℃±3℃冰箱中保存，通常建議平板不超過(guò)2周～4周，瓶裝及試管裝培養基不超過(guò)3個(gè)月～6個(gè)月，除非某些標準或實(shí)驗結果表明保質(zhì)期比上述的更長(cháng)�！薄敖ㄗh需在培養基中添加的不穩定的添加劑應即配即用，除非某些標準或實(shí)驗結果表明保質(zhì)期更長(cháng)；”“培養基的貯存應建立經(jīng)驗證的有效期。觀(guān)察培養基是否有顏色變化、蒸發(fā)（脫水）或微生物生長(cháng)的情況，當培養基發(fā)生這類(lèi)變化時(shí)，應禁止使用�！�
因此，對于含有不穩定成分的培養基平板，最好是現配現用，除非經(jīng)過(guò)效期驗證，可適當延長(cháng)保存期限（可以在2-8℃保存或驗證過(guò)的溫度下保存）；一般較穩定的培養基可在適宜條件下保存2-4周（一般建議在10-25℃左右的環(huán)境保存，溫度過(guò)低時(shí)培養基易出現冷凝水，溫度過(guò)高易導致培養基失水及部分營(yíng)養成分失效），或通過(guò)有效期驗證延長(cháng)保存期限；若保存后的培養基出現明顯外觀(guān)變化或污染微生物，則不能使用。不可在0℃以下結冰保存。
（4）滅菌后的培養基，在47-50℃呈液態(tài)狀可以保存多久？是否可以過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間保存？對培養基性能會(huì )有影響嗎？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質(zhì)量要求》標準中指出，“融化后的培養基放入47℃～50℃的恒溫水浴鍋中冷卻保溫(可根據實(shí)際培養基凝固溫度適當提高水浴鍋溫度)，直至使用，培養基達到47℃～50℃的時(shí)間與培養基的品種、體積、數量有關(guān)。融化后的培養基應盡快使用，放置時(shí)間一般不應超過(guò)4 h�！�
多數培養基中含有蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖等成分，蛋白胨、酵母浸粉中含有多種維生素、微量元素等營(yíng)養成分，在長(cháng)時(shí)間處于較高溫度下保存易導致這些營(yíng)養成分降解，而長(cháng)時(shí)間熱保溫條件下的葡萄糖則易分解焦化，導致培養基pH下降。因此，長(cháng)時(shí)間的保溫會(huì )使培養基的營(yíng)養成分流失，靈敏度下降，培養效果變差，瓊脂的凝膠強度也會(huì )降低。保溫過(guò)夜或更長(cháng)時(shí)間這種操作方法是不規范的，應當按照標準要求，在保溫4h內使用。
（5）按照標準進(jìn)行培養基配制時(shí)，有時(shí)候制成的平板凝膠強度較低，可否增加瓊脂含量來(lái)提高平板的凝膠強度？是否會(huì )對微生物的生長(cháng)造成不良影響？
答：目前市場(chǎng)上的銷(xiāo)售的瓊脂來(lái)源、工藝、純度等各方面存在差異，導致不同的瓊脂凝膠強度存在差別。因此在《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質(zhì)量要求》標準中也明確指出，允許“根據所需凝膠作用的效果改變瓊脂的用量”。
瓊脂在培養基中，主要起固化的作用，因此適量的增加或減少瓊脂含量并不會(huì )對微生物生長(cháng)造成不良影響。但要注意，在使用半固體瓊脂觀(guān)察動(dòng)力時(shí)，若要進(jìn)行瓊脂調整，需進(jìn)行試驗驗證，若培養基添加瓊脂過(guò)多，凝膠強度偏高，會(huì )導致部分細菌動(dòng)力效果不明顯；而對于制成平板的固體培養基，適量調整瓊脂不會(huì )對培養基的靈敏度和生長(cháng)率造成不利影響（即不影響微生物的生長(cháng)和計數），但若瓊脂過(guò)多，平板偏硬，會(huì )使菌落稍偏��；若瓊脂偏少，平板偏軟，會(huì )使一些動(dòng)力強的細菌菌落稍大，甚至蔓延，劃線(xiàn)接種時(shí)也會(huì )出現易劃破平板的問(wèn)題。
（6）平板進(jìn)行涂布接種或劃線(xiàn)接種時(shí)，經(jīng)常出現菌落片狀生長(cháng)或蔓延，是什么原因？
答：通常是由于平皿表面水過(guò)多導致的。剛制備好的平板，可進(jìn)行適當的干燥處理，在培養箱中預培養2h左右或在超凈工作臺中開(kāi)蓋中風(fēng)吹15-30min，降低平板表面的含水量。進(jìn)行涂布操作時(shí)，9cm平板建議接種量為100μL，最高不超過(guò)200μL。
（7）平板在培養箱中培養后，有的平板干裂嚴重，有的平板出水嚴重，是什么原因？如何解決？
答：主要與瓊脂的保水性和彈性、平板厚度、平皿的透氣性、培養箱條件有關(guān)。
瓊脂：不同的瓊脂在保水性方面略有差異，而瓊脂的彈性會(huì )影響是否開(kāi)裂。彈性差的瓊脂在大量失水后，易出現開(kāi)裂；而彈性好的瓊脂在大量失水后，易出現變薄或縮小現象。
平板厚度：平板越薄越容易干裂。通常使用的平板培養基厚度為2-3mm，若培養時(shí)間較長(cháng)或干裂問(wèn)題較嚴重，可適當增加培養基厚度。
平皿的透氣性：新制備的平板一般不容易出現干裂問(wèn)題，而長(cháng)時(shí)間保存的平板更容易出現干裂現象，這主要與平板的透氣性有關(guān)。平板的密封性越好，保存和培養過(guò)程中培養基失水越少。雖然增加平板的密封性可以減少水份流失，但并非密封性越高越好。一些需氧型微生物（如銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），在密閉環(huán)境中生長(cháng)較差，需要良好的透氣性才能較好的生長(cháng)。而對于一些生化鑒定類(lèi)培養基平板（如XLD平板），細菌的生長(cháng)和生化反應的發(fā)生需要有氧氣參與，密閉的平皿反而會(huì )得到較差的實(shí)驗結果。因此在選用平皿時(shí)，需結合實(shí)際情況選擇合適透氣性的平皿。
培養箱條件：培養箱是影響平皿干裂問(wèn)題的關(guān)鍵因素之一。大型的培養箱為了保證內部溫度均一，通常帶有較強的鼓風(fēng)系統，內部有較強的空氣流動(dòng)。而氣流越強，則越容易導致平皿失水。而對于一些沒(méi)有鼓風(fēng)系統的小型培養箱，則很少會(huì )出現平皿干裂現象。在培養箱內擺放平皿時(shí)，應盡量避開(kāi)風(fēng)口氣流大的位置，同時(shí)遠離培養箱內部發(fā)熱板。
因此，在遇到平板干裂問(wèn)題時(shí)，可通過(guò)增加平板培養基厚度、培養箱內增加擋板降低氣流或避開(kāi)風(fēng)口、選擇合適透氣性的平皿、減少使用長(cháng)期存放的平板等方面進(jìn)行解決。
注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。
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