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大腸桿菌是食品污染程度的重要參數指標，是反應食品質(zhì)量的必測項目，因此，很好地掌握其檢測方法以及在檢測全過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法是每一個(gè)食品檢測人都應該具備的技能。
大腸菌群(Coliform bacteria)是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)食品的衛生質(zhì)量，推斷食品中是否有污染腸道致病菌的可能。大腸菌群分布較廣，在溫血動(dòng)物糞便和自然界中廣泛存在。
調查研究表明，大腸菌群多存在于溫血動(dòng)物糞便、人類(lèi)經(jīng)�；顒�(dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染的地方。人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因之一，糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則大腸菌群的其他菌株較多。
一、檢測方法
大腸菌群檢測的關(guān)鍵在于方法的選用，食品中大腸菌群檢測有兩種表示方法，其一是以100mL(g)檢樣內大腸菌群最大可能數(MPN)表示，檢測方法需使用GB/T 4789.3-2003《食品衛生微生物學(xué)檢驗大腸菌群測定》；其二以每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值表示，檢測方法需使用GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》。GB/T 4789.3-2003《食品衛生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》雖然被后更新的方法代替，但衛生部關(guān)于規范食品中大腸菌群指標的檢測工作公告(2009年 第16號)明確指出，為規范食品中大腸菌群指標的檢測工作公告如下：
現行食品標準中規定的大腸菌群指標以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛生微生物學(xué)檢驗大腸菌群測定》(GB/T 4789.3-2003)進(jìn)行檢測;以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”為單位的，適用《食品衛生微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數》(GB/T4789.3-2008)進(jìn)行檢測。后GB/T 4789.3-2008被GB 4789.3-2016替代，故檢測樣品前需根據產(chǎn)品標準認真選擇方法。
例如，GB/T2717-2003醬油衛生標準中對大腸菌群的要求需使用方法一GB/T 4789.3-2003。又如GB/T 2718-2014醬油衛生標準中對大腸菌群的要求需使用方法二GB4789.3-2016。
MPN檢索表使用
GB/T 4789.3-2003檢索表中陽(yáng)性管數是以1mL(g)×3、0.1mL(g)×3和0.01mL(g)×3的梯度進(jìn)行表示，GB 4789.3-2016陽(yáng)性管數是以0.10、0.01和0.001的梯度表示,均按照稀釋倍數推算結果，結果相同。推算方法以GB 4789.3-2016為例，改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內數字應相應降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時(shí),則表內數字應相應增高10倍,其余類(lèi)推即可。
二、常用標準
1、GB/T 4789.3-2003食品衛生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定
2、GB 4789.3-2016食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數
3、GB 4789.28-2013食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養基和試劑的質(zhì)量要求
4、GB 4789.1-2016食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 總則
5、GB 4789.41-2016食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 腸桿科檢驗
6、GB/T 27405-2008實(shí)驗室質(zhì)量控制規范 食品微生物檢測
7、GB/T 16294-2010醫藥工業(yè)潔凈室（區） 沉降菌的測試方法
三、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
1、食品中大腸菌群的檢測有兩個(gè)標準三種方法，該如何選擇呢？
A：依據產(chǎn)品標準的項目單位
若單位為CFU/g，則選擇GB 4789.3-2016第二法（平板計數法）
若單位為MPN/g，則選擇GB 4789.3-2016第一法（MPN計數法）
若單位為MPN/100g，則選擇GB/T 4789.3-2003。
2、MPN法3個(gè)適宜的連續稀釋度該怎樣選擇？
A：依據產(chǎn)品標準的項目標準值
若標準值為＜3.0MPN/g，則選擇0.1g、0.01g、0.001g三個(gè)稀釋度。
若標準值為≤30MPN/100g，則選擇1g、0.1g、0.01g三個(gè)稀釋度。
四、樣品采集
怎樣采樣，才能使樣品具有代表性？ 這里將樣品分為兩類(lèi)：預包裝食品和散裝食品或現場(chǎng)制作食品
1、對于預包裝食品
① 應采集相同批次、獨立包裝、適量件數的食品樣品，每件樣品的采樣量應滿(mǎn)足微生物項目檢驗的要求。
② 獨立包裝小于、等于1000g的固態(tài)食品或小于、等于1000mL的液態(tài)食品，取相同批次的包裝。
③ 獨立包裝大于1000mL的液態(tài)食品，應在采樣前搖動(dòng)或用無(wú)菌棒攪拌液體，使其達到均質(zhì)后采集適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內作為一件食品樣品；大于1000g的固態(tài)食品，應用無(wú)菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內作為一件食品樣品。
2、對于散裝食品或現場(chǎng)制作食品
用無(wú)菌采樣工具從n個(gè)不同部位現場(chǎng)采集樣品，放入n個(gè)無(wú)菌采樣容器內作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應滿(mǎn)足微生物項目檢驗單位的要求。
五、培養基制備過(guò)程容易出現問(wèn)題解答
1、異�，F象一：培養基不凝固
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②低pH造成培養基酸解；
③稱(chēng)量不正確；
④瓊脂未完全溶解；
⑤培養基成分未充分混勻。
2、異�，F象二：pH不正確
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③外部化學(xué)物質(zhì)污染；
④測定pH時(shí)溫度不正確；
⑤pH計未正確校準；
⑥脫水培養基質(zhì)量差。
3、異�，F象三：顏色異常
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③pH不正確；
④外來(lái)污染；
⑤脫水培養基質(zhì)量差。
4、異�，F象四：產(chǎn)生沉淀
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②水質(zhì)不佳；
③脫水培養基質(zhì)量差；
④pH計未正確控制。
5、異�，F象五：培養基出現抑制/低的生長(cháng)率
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②脫水培養基質(zhì)量差；
③水質(zhì)不佳；
④使用成分不正確，如：成分稱(chēng)量不準，添加劑濃度不正確；
⑤制備容器或水中的有毒殘留物。
6、異�，F象六：選擇性差
原因分析：
①制備過(guò)程中過(guò)度加熱；
②脫水培養基質(zhì)量差；
③配方使用不對；
④添加成分的加入不正確，例如加入添加成分時(shí)培養基過(guò)熱或添加濃度錯誤；
⑤添加劑污染。
7、異�，F象七：污染
原因分析：
①不適當的滅菌；
②無(wú)菌操作技術(shù)存在問(wèn)題；
③添加劑污染。
六、實(shí)驗過(guò)程
1、2016版平板法VRBA傾注完，待瓊脂凝固后為什么需要加3-4mL的覆蓋層？
A：因為大腸菌群是需氧及兼性厭氧的，再加一層瓊脂相當于造就一個(gè)半厭氧環(huán)境，促進(jìn)兼性厭氧菌的生長(cháng)，同時(shí)抑制其他菌的生長(cháng)。除此之外，還有防止菌落蔓延的作用，防止遷徙性菌落對菌落計數構成影響。例如一些變形桿菌就會(huì )有遷徙現象，從而導致菌落長(cháng)成一片無(wú)法區分。在表面多覆蓋一層培養基就可以避免這種情況的發(fā)生。
2、GB 4789.3-2016平板法驗證菌落如何挑��？
A：分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落數。按比例挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落,少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個(gè)，典型大腸菌群有6個(gè)。證實(shí)實(shí)驗應該按照可疑跟典型5:3的比例進(jìn)行挑取，移種于BGLB肉湯管內。
七、結果處理
1、所有稀釋度都不在計數范圍內怎么辦？
這種情況一般都是最低稀釋度的平板都小于15CFU，這種情況就是以最低稀釋度的平板菌落數乘以驗證試驗的比例來(lái)計算。例如10倍稀釋的兩個(gè)平板上菌落數分別為10、8，菌落數為10的平皿挑取10個(gè)菌落復發(fā)酵中有8個(gè)菌落產(chǎn)氣，菌落數為8的平皿挑取8個(gè)菌落復發(fā)酵中有7個(gè)菌落產(chǎn)氣，則計算過(guò)程是這樣的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2、連續兩個(gè)稀釋度的四個(gè)平皿的菌落數都在計數范圍內怎么辦？
這個(gè)需要參考菌落總數檢測國標里7.1.2里的公式計算。我們需要先計算每個(gè)平皿的驗證后的菌落數，再代入公式計算即可。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數為120和125,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數為17和16，經(jīng)過(guò)復發(fā)酵驗證產(chǎn)氣的管數分別為7、8、8、8，則我們先計算每個(gè)平皿上的菌落數分別為120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=13.6（我們計14），16*8/10=12.8（我們計13），然后將84、100、14、13四個(gè)數代入公式：（84+100+14+13）/（2+0.2）*10=959，結果應報告960CFU/g（mL）。
3、只有一個(gè)稀釋度的一個(gè)平皿的菌落數在計數范圍，其他均不在計數范圍怎么辦？
這樣我們只需要復發(fā)酵驗證這一個(gè)平皿即可，根據這一個(gè)平皿的菌落數進(jìn)行報告。例如10倍稀釋度兩個(gè)平皿菌落數為160和142,100倍稀釋度兩個(gè)平皿的菌落數為12和13，則我們只需要從菌落數為142CFU的平皿里挑取10個(gè)菌落進(jìn)行復發(fā)酵驗證即可，假如共有7支發(fā)酵管陽(yáng)性，則應計算142*7/10=99.4，結果報告99CFU/g（mL）。
本文轉載自微信公眾號實(shí)驗與分析。
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