培養基滅菌后顏色變深的原因探究及預防措施

一、滅菌后顏色變深的原因

  葡萄糖是微生物培養過(guò)程中常用的有效碳源，但含葡萄糖的培養基經(jīng)高溫滅菌后，容易產(chǎn)生有害色素，其色素成分比較復雜，俗稱(chēng)焦糖色，主要是還原糖與氨基酸物質(zhì)高溫條件下發(fā)生的美拉德反應所致。

  下面大概介紹一下這種反應的機理：

  1912年法國化學(xué)家路易斯﹒卡米拉﹒美拉德在實(shí)驗中偶然發(fā)現：羰基化合物（還原糖）的羰基可以與氨基化合物（氨基酸/多肽/蛋白質(zhì)）中的氨基發(fā)生反應，該反應經(jīng)過(guò)一系列復雜歷程最終生成棕黑色的大分子物質(zhì)類(lèi)黑素或稱(chēng)擬黑素，該羰氨反應又稱(chēng)美拉德反應。

  經(jīng)過(guò)各國學(xué)者多年研究，目前公認的美拉德反應機理可分以下三個(gè)階段：

  起始階段：還原糖與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生縮合反應，生成具有亞胺或甲亞胺特性基團的有機化合物，即席夫堿；席夫堿環(huán)化生成氨基糖；氨基糖經(jīng)重排生成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。

  中間階段：在酸性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)1,2-烯醇化反應，生成5-羥甲基糠醛；堿性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)2,3-烯醇化反應，生成還原酮類(lèi)和脫氫還原酮類(lèi)；1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)降解反應生成醛類(lèi)和吡嗪類(lèi)等化合物。

  最終階段：該階段反應較為復雜，歷程尚未完全明確，大致是中間階段的產(chǎn)物與氨基化合物聚合反應生成高分子結構不明的類(lèi)黑素，此外還有一系列中間體還原酮及揮發(fā)性雜環(huán)化合物生成。

二、美拉德反應的危害

  有研究表明，美拉德反應的反應速率隨溫度的增長(cháng)呈現急劇升高的趨勢，且美拉德反應部分中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物具有抑制微生物生長(cháng)的作用，因此在微生物發(fā)酵工業(yè)中為避免還原糖類(lèi)碳源與氨基化合物類(lèi)氮源在高溫下發(fā)生美拉德反應，通常將碳源和氮源分開(kāi)滅菌，待冷卻后再將其混合進(jìn)行微生物發(fā)酵，而該工藝手段通常存在滅菌能耗較高、設備投入成本較大的問(wèn)題。同時(shí)，美拉德反應產(chǎn)物還具有人們不需要的色澤和一定的致癌性，因此目前關(guān)于降低或抑制美拉德反應的文獻報道主要集中在食品、醫藥等領(lǐng)域，而在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的相關(guān)報道較少。

三、預防措施

  有人在實(shí)際工作中發(fā)現微量焦糖對許多細菌和酵母菌有明顯的抑制作用，建議在配制細菌或酵母菌的含糖培養基時(shí)不宜采用高溫滅菌手段，應采用過(guò)濾除菌方法。有報道稱(chēng)，采用亞硫酸鈉可部分抑制美拉德反應，但亞硫酸鈉本身有抑菌作用，在微生物培養中不能借鑒，而過(guò)濾除菌操作繁瑣，還有人專(zhuān)門(mén)研究，將KH2PO4與葡萄糖一起滅菌在pH5.5時(shí)單獨滅菌或與非氨類(lèi)的無(wú)機鹽共同滅菌，能減少色素的產(chǎn)生，但滅菌后的培養基還要再按各種要求調整pH，勢必又會(huì )引入未知的雜菌，這種方法也缺乏可操作性。

  基于上面的理論知識，結合實(shí)際工作中的一些經(jīng)驗，我們提出：

 （1）對于一些含糖量高的培養基，一定要嚴格控制滅菌溫度和滅菌時(shí)間，通常在115℃滅菌20分鐘即可；

 （2）滅菌完畢，及時(shí)取出，不要在鍋內放置很長(cháng)時(shí)間；

 （3）滅菌時(shí)，鍋內物品不要堆放過(guò)滿(mǎn)，以免由于不同部位受熱不均，造成不同瓶?jì)扰囵B基顏色差異。

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