電子顯微鏡樣品的制備

  一、目的要求
學(xué)習并掌握制備微生物及核酸電鏡樣品的基本方法．
二、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的主要區別
顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長(cháng)．1933 年開(kāi)始出現的電子顯微鏡正是由于使用了彼長(cháng)比可見(jiàn)光短得多的電子束作為光源，使其所能達到的分辨率較光學(xué)顯微鏡大大提高。而光翻的不同，也決定了電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的一系列差異 
根據電子束作用于樣品的方式的不同及成像原理的差異，現代電子顯微鏡已發(fā)展形成了許多種類(lèi)型，目前最常用的是透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡，前者總放大倍數可在1000~ 1000000 估范圍內變化，后者總放大倍數可在20~3 000000 倍之間變化．本實(shí)驗主要介紹這兩種顯微鏡樣品的制備．
三、器材
1 菌種大腸桿菌（大腸埃希氏菌）斜面．
2 ．溶液或試劑醋酸戊脂，濃硫酸，無(wú)水乙醇，無(wú)菌水，2 ％磷鎢酸鈉（pH6 . 5 一8.0 ）水冷液，。3 ％聚乙烯甲醛溶液，細胞色素c ，醋酸鐵，質(zhì)粒PBR322 . 
3 ．儀器或其他用具普通光學(xué)顯微鏡，銅網(wǎng)，瓷漏斗，燒杯，平皿，無(wú)菌滴管，無(wú)菌鑷子．大頭針，載玻片，細菌計數板，真空鍍膜機，臨界點(diǎn)干燥儀等
四、操作步驟
（一）透射電鏡的樣品制備及觀(guān)察
1 ．金屬網(wǎng)的處理
光學(xué)顯微鏡的樣品是放置在載玻片上進(jìn)行觀(guān)察，而在透射電鏡中，由于電子不能穿透玻璃，只能采用網(wǎng)狀材料作為載物．通常稱(chēng)為載網(wǎng)．載網(wǎng)因材料及形狀的不同可分為多種不同的規格，其中最常用的是2 陽(yáng)～400 目（孔數）的釗網(wǎng)。網(wǎng)在使用前要處理，除去其上的污物，否則會(huì )影響支持膜的質(zhì)量及標本照片的清晰度。本實(shí)驗選用的是400 目的銅網(wǎng)，可用如下方法進(jìn)行處理：首先用醋酸戊酷授漂幾小時(shí)，再用蒸餾水沖洗數次，然后再將銅網(wǎng)浸漂在無(wú)水乙醇中進(jìn)行脫水。如果銅網(wǎng)經(jīng)以上方法處理仍不干凈時(shí)，可用稀釋的濃硫酸（l : l ）浸1~2 min ，或在1%NaOH 溶液中煮沸數分鐘．用蒸餾水沖洗數次后，放人無(wú)水乙醇中脫水，待用．
2 ．支持膜的制備
在進(jìn)行樣品觀(guān)察時(shí)，在載網(wǎng)上還應覆蓋一層無(wú)結構、均勻的薄膜．否則細小的樣品會(huì )從載網(wǎng)的孔中漏出去，這層薄膜通常稱(chēng)為支持膜或載膜．支持膜應對電子透明，其厚度一般應低于20nm ；在電子束的沖擊下，該膜還應有一定的機械強度，能保持結構的穩定，并擁有良好的導熱性；此外，支待網(wǎng)在電鏡下應無(wú)可見(jiàn)的結構，且不與承載的樣品發(fā)生化學(xué)反應，不干擾對樣品的觀(guān)察，其厚度一般為15nm左右．支持膜可用塑料膜｛如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鍬膜等） ．常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求，而塑料膜中火棉膠膜的制備相對容易．但強度不如聚乙烯甲醛膜．
( l ）火棉膠膜的制備在一干凈容器〔 燒杯、平皿或下帶止水夾的瓷漏斗）中放人一定量的無(wú)菌水，用無(wú)菌滴管吸2 ％火棉膠醋酸戊醋溶液，滴一滴于水面中央，勿振動(dòng)，待醋酸戊酪蒸發(fā)，火膜膠則由于水的張力隨即在水面上形成一層薄膜．用鑷了將它除掉，再重復一次此操作，主要是為了清除水面上的雜質(zhì)．然后適量滴一滴火棉膠液于水面，火棉膠液滴加量的多少與形成膜的厚薄有關(guān)，待膜形成后檢查膜是否有皺折，如有，則除去一直待膜制好．
( 2 ）聚乙烯甲醛膜的制備
① 洗下凈的玻璃板插人0.3％formvar 溶液中靜置片刻（時(shí)間視所要求的膜的厚度而定），然后取出稍稍晾干使會(huì )在玻確板上便形成一層薄膜；
② 用鋒利的刀片或針頭將膜刻一矩形；
③ 將玻板輕輕斜插進(jìn)盛滿(mǎn)無(wú)菌水的容器中，借助水的表面張力作用使膜與玻片分離并漂浮在水面上．
3.轉移支持膜到載網(wǎng)上，可有多種方法，常用的有如下二種：
〔 l ）將洗凈的網(wǎng)放人瓷漏斗中，漏斗下套上乳膠管，用止水夾控制水流，緩緩向漏斗內加入無(wú)菌水，其量約高1cm ；用無(wú)菌鑷子尖輕輕排除銅網(wǎng)上的氣泡，并將其均勻地櫻在漏斗中心區域；按2 所述方法在水面上制備支持膜，然后松開(kāi)水夾，使膜緩緩下沉，緊緊貼在銅網(wǎng)上；將一清潔的濾紙筱蓋在翻斗上防塵，自然干燥或紅外線(xiàn)燈下烤干．千澡后的膜，用大頭針尖在銅網(wǎng)周?chē)鷦澮幌�，用無(wú)菌攝子小心將銅網(wǎng)膜移到載玻片上，置光學(xué)顯微鏡下用低倍鏡挑選完整無(wú)缺，厚薄均勻的銅網(wǎng)膜備用
( 2 ）按2 所述方法在平皿或燒杯里制備支持膜，成膜后將幾片銅網(wǎng)放在膜上．再在上面放一張濾紙，浸透后用銀于將濾紙反轉提出水面．將有膜及銅網(wǎng)的一面朝上放在干凈平皿中，置40 ℃ 烘箱使干燥．
4 ．制片
透射電鏡樣品的制備方法很多，如超薄切片法、復型法、冰凍蝕刻法、滴液法等，其中滴液法，或在滴液法基礎上發(fā)展出來(lái)的其他類(lèi)似方法如直接貼印法、噴霧法等主要被用于觀(guān)察病毒粒子、細菌的形態(tài)及生物大分子等．而由于生物樣品主要由碳‘氫、氧、氮等元素組成，散射電子的能力很低，在電鏡下反差小，所以在進(jìn)行電鏡的生物樣品制備時(shí)通常還須采用重金屬鹽染色或金屬?lài)婂兊确椒▉?lái)增加樣品的反差，提高觀(guān)察效果。例如負染色法就是用電子密度高，本身不顯示結構且與樣品幾乎不反應的物質(zhì)吃如瞬鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來(lái)對樣品進(jìn)行“染色，．由于這些重金屬鹽不被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周，如果樣品具有表面結構，這種物質(zhì)還能穿透進(jìn)表面上凹陷的部分，因而在樣品四周有染液沉積的地方，散射電子的能力強，表現為暗區，而在有樣品的地方散射電子的能力弱，表現為亮區，這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來(lái)．負染色法由于操作簡(jiǎn)單，目前在進(jìn)行透射電鏡生物樣品制片時(shí)比較常用．本實(shí)驗將主要介紹采用滴液法結合負染色技術(shù)觀(guān)察細菌及核酸分子的形態(tài)．
五、實(shí)驗報告
1 ．結果
描述你所制備的細菌和PBR322 質(zhì)粒DNA 電鏡制片在電子顯傲鏡下所觀(guān)察到的形態(tài)特點(diǎn)．
2 思考題
( l ）利用透射電子顯微鏡來(lái)觀(guān)察的樣品為什么要放在以金屬網(wǎng)作為支架的火棉膜（或其他膜）上？而掃描電子顯微鏡則可以將樣品固定在蓋玻片上？
（2）用負染色法制片時(shí)，磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀起什么作用？
 
   

 

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