隨機擴增DNA多態(tài)性分析

  隨機擴增DNA多態(tài)性分析(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)又稱(chēng)為隨意引物PCR(Arbitrary Primed PCR, AP-PCR)是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù)，其理論依據是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數目可能不同，因而用一組人設計的核昔酸作為引物，通過(guò)PCR隨機擴增可產(chǎn)生物種 特異性的DNA帶譜。因此RAPD技術(shù)可用于細菌種間、亞種間乃至株間的親緣關(guān)系分析，未知菌株的快速鑒定和流行病學(xué)調查等。此外，RAPD的PCR產(chǎn)物還可作為探針，與Southern雜交技術(shù)結合，用于基因組或菌落雜交，可以填補基因組的遺傳圖譜和物理圖譜間的空缺。

  RAPD技術(shù)是1990年Williams和Welsh兩個(gè)實(shí)驗室分別建立的，Williams將通常PCR擴增中使用的特定序列引物巧妙地改為單一的僅由10個(gè)堿基的隨機序列引物；而Welsh則使用幾組通用引物，通過(guò)設置PCR擴增參數也達到了產(chǎn)生物種 特異性的DNA指紋圖。他們的研究賦予了RAPD顯著(zhù)的優(yōu)點(diǎn)：在對基因組序列一無(wú)所知的前提下即可分析其DNA的多態(tài)性；方法的簡(jiǎn)單快捷和高度重復性可普及應用。

(一)方法一

  1.細菌基因組DNA制備

  以葡萄球菌(Staphylococcus)為例。菌株在2～5 ml的心腦浸液培養基中培養過(guò)夜，收集細胞并溶于0.2 ml的TE緩沖液；加入0.2 mg/ml的金葡溶菌酶,在37t保溫lh;加入0.2 ml蛋白酶K溶液（0.5mg/ml蛋白酶K,1% SOS,200 m mol/L EDTA,1 mmol/L CaCl2)，50℃保溫lh;澄清的上清用酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA;將DNA溶于TE中，并在瓊脂糖凝膠上電泳測定終濃度。

  2.PCR擴增引物

  引物I: Kpn-R: CCAAGTCGACATGGCACARTGTATACATAYGTAAC

  引物II: pBs: GGA.GGAAACAGCfATGACCATGA

  3.AP-PCR

  初級反應體系10μl: 0.025UTaqDNA聚合酶，Taq緩沖液(strata-gene)含4 mmol/LMgCh, 0.2 mmol/L各個(gè)dNTP,10 μ mol/LKpn-R引物或PBS引物，和DNA模板（濃度：30 pg-7.5 ng)。首先進(jìn)行兩個(gè)低強度PCR循環(huán)：94℃, 5min; 40℃, 5 min; 72℃,5 min; 10高強度PCR循環(huán)：94℃,1 min; 60℃,1 min; 72℃,2 min;加入二級反應體系：2.25UTaq, Taq緩沖液，0.2 mmol/L各個(gè)dNTP和50μ Ciα- [32P] dCTP，繼續進(jìn)行20-30個(gè)高強度PCR循環(huán)。

  4.聚丙烯酰氨凝膠電泳分離AP-PCR產(chǎn)物和放射自顯影

  PCR產(chǎn)物在5％的聚丙烯酰氨凝膠上電泳分離，1kb的標準分子量DNA作為對照，TBE作為電泳緩沖液。用Kodak XAR-5膠片進(jìn)行放射自顯影。

(二)方法二

  1.DNA的純化

  同上

  2.引物設計

  引物設計遵照如下原則：①長(cháng)度為9～10核甘酸；②G+C mol％范圍50- 80,③無(wú)回文結構。如：隨機引物0995: 5'CCGAGTCCA3';或隨機引物5'TGGTCAC'TGA3'。

  3.PCR擴增

  25 μl的反應體系：10 mmol/LTris-HCI (pHS.3); 50 mmol/LKCI;2mmol/LMgCl2; 0.01％明膠；100 μmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTIP; 0.2μmol/L引物；25ng基因組DNA; 0.5UTaq聚合酶。

    94℃, 1 min; 36℃, 1 min; 72℃, 2 min。

  4.PCR產(chǎn)物

  在1.4％瓊脂糖凝膠上電泳分離。

（三）影響AP-PCR的因素

  (1) PCR的退火溫度可能影響AP PCR帶譜的特異性和重復性，但其影響程度取決于引物的長(cháng)度，引物長(cháng)時(shí)影響不大可使用高退火溫度；引物短時(shí)影響大因而退火溫度要低 以保證引物與模板的結合。

  (2)模板濃度：DNA的模板濃度以30pg-7.5ng為適宜，lOpg是低限。

  (3)引物選擇：AP-PCR的引物不需特異選擇，尤其當用于種的鑒定時(shí)。但不同序列的引物擴增的PCR多態(tài)性不同，尤其是種或株特異性的DNA片段。

  本文節選自《常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊》第十五章。

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