DNA/DNA（雜交）同源性測定

(一)菌體收集和DNA提取

  同“DNA的G+C含量測定”部分。

(二)DNA/DNA同源性測定方法

  現介紹應用較多的兩種:

  1.復性率方法:

   (1)DNA樣品處理：用溶菌酶或SDS等破壁提取的DNA絲狀溶解物，實(shí)驗前需先置冰浴中用超聲波50 W超聲4次，每次15 s,間隔1-2min,使DNA片段在2～5 x 105dalton;用超聲破壁提取的DNA溶液,不再做超聲處理。

   (2)DNA變性：將剪切過(guò)的待測DNA樣品(A、B)分別用O.lSSC精確配制成OD260為1.5或2.0（約50 μg/0D)；取樣品A、B各3 ml分別裝在兩支中試管里，再取A,B各1.5ml裝在同一支試管中混勻為樣品M。A、B、M三個(gè)樣品測試前分別置沸水浴中變性10 min,用預熱的1 ml吸管吸預熱的lOSSC O72 ml加入上述變性樣品中，稍加混勻,使最終濃度為2SSC。

   (3)測定DNA的復性速率：①開(kāi)機和選擇測量條件，打開(kāi)分光光度計，待儀器校正后，選擇時(shí)間掃描，固定260 nm波長(cháng)，選擇3 mm/min的掃描 速度自動(dòng)控制時(shí)間，并使記錄紙上的量程放大2-2.5倍。②預熱比色架和比色杯（裝有2SSC)。用半導體點(diǎn)溫計通過(guò)熱敏電阻探頭監視杯中溶液的溫度，使其穩定在指定的最適復性溫度（TOR）。③上樣：待達到TOR后，棄去比色杯中的2SSC溶液，迅速轉入變性DNA樣品液，同時(shí)接通熱敏電阻，觀(guān)察溫度。全部過(guò)程不得使樣品的溫度低千TOR。④測定復性率：待測試樣品的溫度達到TOR時(shí)，開(kāi)始記錄相應的吸光度，以此為零時(shí)，隨后每隔5 min讀數一次，待反應進(jìn)行到30 min時(shí)，停止掃描。最終得到一條隨時(shí)間延長(cháng)、吸光值逐漸減小的直線(xiàn)。⑤計算復性速率：用零時(shí)的吸光度減去30 min時(shí)的吸光度，除以總時(shí)間(30 min)，得出直線(xiàn)的斜率， 即DNA的復性速率（通常用V表示單位為每分鐘吸光值的減少值）。 每個(gè)樣品需重復測試2～3次。計算：
   0min～30min的吸收值/30min=V（復性率）

   4Vm-（Va-Vb）/2√VaVb X 100

   Va、Vb和Vm分別表示A、B樣品和M為混合樣品的復性速率。

  2.固相分子雜交方法

   （1）制膜：取0.2 mlDNA溶液（含量約為10 μg/0D)，加入蒸熘水至2.5 ml,于lOO℃變性10 min,轉入冰浴，加入預冷的12 X SSC 2.5 ml,減壓慢速濾過(guò)微孔膜(GSWP,孔徑0.22 μm,膜徑為25 mm,用前在蒸餾水和6XSSC中分別浸泡半小時(shí)），再以25 ml 6 x SSC抽濾洗膜（收集DNA的濾液，測其OD₂₆₀,與濾前相比較，可求得吸附率），濾膜于室溫過(guò)夜，然后以不銹鋼打孔器刻得6 mm直徑的小膜，于80℃烘干4 h,最后放入真空干燥器內，4℃保存備用。

   （2）標記：取100 μg變性DNA溶液于0.1 mol/LNaAc-0.04 mol/LHAc (pH 5.0)溶液中，置冰浴，并依次加入KI (2.5 m mol/L水溶液），使終濃度為0.25 m mol/L；加Na125I 200-400 μCi混合，最后加入三氯化駝（6.5 X 10-2mol/LTiCl3水溶液），使其終濃度為6.5 X 10-3mol/L�？偟姆磻�體積為0.3-0.ml�；旌衔镌�60℃水浴中保溫20 min,冷卻加入新配制的0.1 mol/L NH₄Ac-0.5 mol/LN比OH調pH至8.7, 60℃保溫20 min,冷卻。上Sephadex G50柱(32 x 1.5 cm)，以重蒸餾水洗脫，并收集6～7管(2-3 ml／管）。每管取IOμl滴于小濾紙片，干燥，投入盛5 ml液閃液[0.4% 2, 5－二苯惡唑，0.01%1, 4－雙（苯基惡唑基-2)－苯的甲苯液］的測量瓶?jì)�，以NE 8312液閃測量?jì)x測量放射性強度，同時(shí)用紫外分光光度計測量每管的OD260。其中皆高者為己標上¹²⁵I的DNA溶液，置冰箱保存備用。

   （3）雜交：將6張載有變性DNA的小膜和1張對照的空白小膜一同置于瓶（直徑3 cm,高4.5 cm)內，加入2 ml Denhardt預溫液(3XSSC中含有0.02％菲可，0.02%聚乙烯吡咯烷酮和0.02％牛血清白蛋白）， 加塞置37℃處理5 min,然后吸出預溫液。加入經(jīng)4號針頭(2 ml針管）反復壓擠剪切15-20次的125I-DNA液，含標記DNA約3 μg，加入12SSC和2% SDS,使總反應體積約1 ml。 反應液的SSC的終濃度為2XSSC, SDS的濃度為0.1%。 塞緊塞子，置60℃水浴中反應15h,吸出反應液，用2XSSC在60℃下洗膜3次，干燥小膜，加5 ml液閃液，置液閃儀測置其放射性。

   （4）同源性百分數計算：以參考菌株標記的DNA與自身未標記的DNA雜交膜（簡(jiǎn)稱(chēng)同源膜）所測得脈沖數減去空白膜脈沖數，與參考菌株標記的DNA和測定菌株未標記的DNA雜交膜（簡(jiǎn)稱(chēng)異源膜）脈沖數也減去空白膜的脈沖數，然后二者相比，得出參考菌株和測定菌株之間的同源性分數。如公式所示：
   同源性%=(異源膜脈沖數-對照膜脈沖數)/(同源膜脈沖數-對照脈沖數) X100

   本文節選自《常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊》第十五章。

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