細胞壁的化學(xué)組成分析法

1.全細胞分析法（薄層層析法）

  （1）材料：①微晶纖維(Cellulose microcrystalline)；②層析缸：21cm x 6cm；③普通玻璃板：20cm X 5 cm；④標準氨基酸，糖。

  （2）方法：

   1）制板：把玻璃板洗凈，取微晶纖維每g加蒸餾水3.5ml（置三角瓶中）調成均勻糊狀；在玻璃板上涂成薄層，每個(gè)板約微晶纖維1.2-1.5 g,風(fēng)干，不需要活化，即可使用 。

   2）用菌株生長(cháng)的液體培養基，分裝于20 cm X 2 cm試管中，每管8ml。滅菌后接種并在搖床培養3～5天后，過(guò)濾培養液，用蒸餾水沖洗菌體兩次，再用無(wú)水乙醇沖洗兩次。取經(jīng)上述處理過(guò)的混菌體30mg裝于硬質(zhì)玻璃管內(0.9 cm X 12 cm)，用于氨基酸分析，另取30mg用于糖組份分析。

   3）菌體水解；在做氨基酸分析的玻璃管中放入6N HCl 0.1ml。在做糖分析的玻璃管中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口，放入烘箱， 溫度上升120℃后，再持續15 min取出。用于氨基酸分析的水解液以黑褐色為宜，用于糖分析的水解液以黃棕色為宜。

   4）點(diǎn)樣：用微量進(jìn)樣器抽取0.4μl氨基酸水解液點(diǎn)在薄板距下緣1 cm處，并點(diǎn)0.01 mol D,L-DAP,同時(shí)點(diǎn)含有L,L-DAP, meso-DAP和D-DAP的 標準氨基酸混合液，以及天門(mén)冬氨酸，甘氨酸，谷氨酸，丙氨酸0.2 μl標準樣。取另一薄板，以相同方法點(diǎn)含有1％鼠李糖，核糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖的混合液0.2μ1作為標準樣。

   5）展層劑：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水(10:1:0.25:5)；糖分析：乙酸乙酷：吡啶：冰乙酸（8:5:1.5）。

   6）展層：點(diǎn)好的薄板直接放入層析缸中，不需要飽和，層析時(shí)間約3h。

   7）顯色：氨基酸分析：用0.4％莉三酮（水飽和正丁醇）；糖分析：用苯胺，鄰苯二甲酸。

   以上分別噴顯色劑顯色：置100-110℃，2-5min,顯出顏色。核糖、木糖和阿拉伯糖顯色后呈粉紅色，其他糖呈褐黃色。

2.純細胞分析（薄層層析法）

  （1）材料：同全細胞分析法。

  （2）方法：

   1)制板：同全細胞分析法

   2）菌體收集：取10 g對數后期濕菌體（不得用于菌體或開(kāi)始自溶的菌體，也不要在室溫下保存的菌體，如需保存應把菌體保存在冰凍狀態(tài)下），懸浮于30-40ml,0.1 mol/L pH8.0磷酸緩沖液中，用超聲波破菌體，菌體破碎后，先用3000r/min離心3 min除去未破碎的菌體，上清液再以15000-16000 r/min離心，得到破碎的細胞壁。當菌體的全細胞糖型為A（含半乳糖和阿拉伯糖）的菌較難破碎也較難沉淀，可適當延長(cháng)破碎和離心時(shí)間。這樣得到的細胞壁沉淀物用pH 8.0的磷酸緩沖液，95％的乙醇分別清洗二次，然后在2％的乙醇KOH溶液(2 g KOH溶于100 ml 95％乙醇中）中皂化(37℃振蕩2～3天），再用95％乙醇，蒸餾水分別清洗二次，再用過(guò)濾過(guò)的含胰蛋白酶的pHS.O磷酸緩沖液（緩沖液中含胰蛋酶3 mg/ml)處理粗制細胞壁(37℃振蕩2h)，用pH S.O磷酸緩液，蒸餾水各清洗二次，清洗后的沉淀物再用胃蛋白酶的鹽酸溶液(3 mg/ ml 0.02N HCI)處理(37℃振蕩過(guò)夜）。然后再0.02N HCI、蒸餾水、乙醇分別清洗2次，最后用氯仿清洗一次，得純細胞壁。

   3）菌體水解：同全細胞分析法

   4）點(diǎn)樣：同全細胞分析法

   5）展層法：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:0.5:0.125:2.5）；糖分析：同細胞壁分析法。

   6)顯色劑及顯色：同全細胞分析。

  本文節選自《常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊》第十四章。

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