霍亂弧菌檢驗標準操作程序

1   方法來(lái)源

1.1  進(jìn)出口食品中霍亂弧菌檢測方法(SN/T 1022-2010)

1.2  衛生部《霍亂防治手冊》第六版(2013年)

2   適用范圍

   本程序規定了食品中霍亂弧菌（Vibrio cholera）的檢驗方法。本程序適用于食品中霍亂弧菌的檢驗。

3   設備和材料

   除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

3.1  恒溫培養箱：36℃±1 ℃。

3.2  恒溫培養箱：41.5℃±1℃。

3.3  冰箱：2℃～5℃。

3.4  恒溫水浴箱：36℃±1℃。

3.5  均質(zhì)器或無(wú)菌乳缽。

3.6  天平：感量0.1 g。

3.7  無(wú)菌試管：18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.8  無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

3.9  無(wú)菌錐形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。

3.10 無(wú)菌培養皿：直徑90mm。

3.11 微生物生化鑒定系統。

3.12 無(wú)菌手術(shù)剪、鑷子。

4  培養基和試劑

4.1 堿性蛋白胨水：見(jiàn)附錄A中A.1。

4.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.2。

4.3 4號瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.3。

4.4 慶大霉素瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.4。

4.5 商品化生化鑒定試劑：見(jiàn)附錄A中A.5。

5  檢驗程序

6.  操作步驟

6.1  樣品處理

稱(chēng)取25g樣品放入盛有225mL堿性蛋白胨水的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mL堿性蛋白胨水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內，加225mL堿性蛋白胨水，并充分振蕩。

如為冷凍產(chǎn)品,應在45℃以下不超過(guò)15 min,或2 ℃～5℃不超過(guò)18h解凍。

6.2  一次增菌

將深凍樣品、干品、腌漬產(chǎn)品于36℃±1℃培養6h～8h，新鮮樣品41.5℃±1℃培養6h～8h（如無(wú)明顯的細菌生長(cháng)現象則繼續培養，但不能超過(guò)20 h）。

6.3  二次增菌

同時(shí)吸取上述一次增菌的表層增菌液0.2mL，加入10mL堿性蛋白胨水管中，36℃±1℃培養6 h～8 h。

6.4  分離

6.4.1 在所有顯示生長(cháng)的一、二次增菌管中用接種環(huán)沾取一環(huán)表層增菌液，分別于TCBS（或科瑪嘉弧菌顯色培養基）平板、4號瓊脂（或慶大霉素瓊脂）平板上劃線(xiàn)分離。于36℃±1℃培養18 h～24 h。

6.4.2 各種平板上霍亂弧菌的典型菌落特征見(jiàn)表1。

表1 霍亂弧菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

6.4.3 純培養

每個(gè)平板上各挑取5個(gè)或以上可疑菌落（少于5個(gè)全部挑�。�，接種于營(yíng)養瓊脂斜面（或平板），36℃±1℃培養18h～24h。

6.5  初步鑒定

6.5.1 氧化酶試驗

挑選純培養的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗，霍亂弧菌為陽(yáng)性。

6.5.2 粘絲試驗

挑選純培養的單個(gè)菌落進(jìn)行粘絲試驗，霍亂弧菌為陽(yáng)性。

6.5.3 涂片鏡檢

將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀(guān)察形態(tài)�；魜y弧菌為革蘭氏陰性，呈弧形、逗點(diǎn)狀等多形態(tài)，無(wú)芽胞。

6.5.4 挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，轉種三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃

±1℃培養24 h觀(guān)察結果�；魜y弧菌在三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色變黃。

6.6  確定鑒定

初步鑒定結果相符者用微生物生化鑒定系統或商品化生化鑒定試劑進(jìn)行系統鑒定。

6.7  血清鑒定分型

6.7.1 血清鑒定

自營(yíng)養瓊脂斜面上挑取純培養物與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。玻片凝集用血清的效價(jià)一般應為1：40～1：50。如可疑菌落在血清中很快（一般在10 s內）出現肉眼可見(jiàn)的明顯凝集，在生理鹽水中不凝集者判為陽(yáng)性。均不凝集方可報告未檢出O1群及O139群霍亂弧菌。

6.7.2 O1群霍亂弧菌血清分型

上述確定為O1群霍亂弧菌的培養物，分別使用小川型及稻葉型單價(jià)血清做玻片凝集，同時(shí)做生理鹽水對照。

6.8  報告

當檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要求，同時(shí)與霍亂弧菌診斷血清凝集（生理鹽水不凝集），報告25g（mL）樣品中檢出霍亂弧菌�；魜y弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見(jiàn)表2。

表1 霍亂弧菌的生化性狀

表2 霍亂弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別

7.  毒力基因檢測

如鑒定結果為霍亂弧菌，需進(jìn)行ctxAB基因的檢測。注意：也可采用經(jīng)過(guò)驗證的商品化試劑盒。

7.1  DNA模板的制備

取適量純培養菌落加入500μL滅菌dH2O中混勻，煮沸10min，15000×g離心3 min。取上清液儲存在-20℃直至使用。也可以用商業(yè)化的DNA提取試劑盒，按其說(shuō)明提取制備DNA模板。

7.2  PCR擴增

7.2.1 引物

可使用引物對5'-ATT TTG AGG TGT TCC ATG TG-3'和5'-ATA AAGCAGTCA GGT GGT CT-3'。擴增產(chǎn)物全長(cháng)749bp。

7.2.2 陰、陽(yáng)性對照設置

陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應的模板；

陽(yáng)性對照采用含有檢測序列的DNA（或質(zhì)粒）作為PCR反應的模板。

7.2.3 PCR擴增反應體系

7.2.5 電泳

用0.5.5c序制備1.5％的瓊脂糖凝膠（含EB或Goldview 0.5μg /mL）。取5μL產(chǎn)物點(diǎn)樣（可包括適量上樣緩沖液），用DNA分子量標記物做參照，電壓100 V，電泳50 min（根據實(shí)驗室儀器情況確定具體電泳條件）。使用凝膠成像系統對電泳結果進(jìn)行保存和分析。

7.3  結果判定

陰性對照未出現條帶，陽(yáng)性對照出現預期大小的擴增條帶條件下，如待測樣品出現749 bp大小的擴增條帶，則可判定該菌株攜帶ctxAB基因；未出現749bp大小的擴增條帶，則可判定不攜帶ctxAB基因。

如果陰性對照出現條帶和/或陽(yáng)性對照未出現預期大小的擴增條帶，本次待測樣品的結果無(wú)效，應重新進(jìn)行試驗，并排除污染因素。

上一篇：彎曲菌檢驗標準操作程序

下一篇：創(chuàng )傷弧菌檢驗方法GB4789.44-2020