彎曲菌檢驗標準操作程序

1   方法來(lái)源

    GB 4789.9-2014《中華人民共和國國家標準食品微生物學(xué)檢驗 空腸彎曲菌檢驗》，定量檢測方法和PCR鑒定方法來(lái)源于2013年衛生部食品安全優(yōu)先評估項目《雞肉中彎曲菌定量評估》和相關(guān)文獻。

 

2   適用范圍

    本程序規定了食品中彎曲菌[空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、結腸彎曲菌(Campylobactercoli)、海鷗彎曲菌(Campylobacter lari)、烏普薩拉彎曲菌(Campylobacterupsaliensis)和胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus）]的檢驗方法。

    本程序適用于生禽肉和生畜肉中彎曲菌的檢驗。

3   設備和材料

    除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

3.1  冰箱：2℃～8℃，-20 ℃，-80 ℃。

3.2  恒溫振蕩培養箱：42℃±1℃。25℃±1℃

3.3  水浴裝置：36℃±1℃，100℃±1℃。

3.4  微需氧培養裝置：能夠提供微需氧條件（5%O2、10%CO2和85%N2），如三氣培養箱、使用產(chǎn)氣劑的厭氧罐/袋或其它可代用的裝置等。

3.5  電子天平：感量0.01g。

3.6  無(wú)菌均質(zhì)袋。

3.7  顯微鏡：10×～100×，有相差功能。

3.8  離心機：離心力≥ 20000×g。

3.9  全自動(dòng)微生物鑒定系統。

3.10  漩渦混勻儀。

3.11  基因擴增儀。

3.12  電泳儀。

3.13  凝膠成像系統。

3.14  具塞試劑瓶（或三角瓶）：500mL，1000mL；玻璃試管：15mL；L玻璃棒。

3.15  無(wú)菌槍頭：10μL,200μL, 1000μL。

3.16  無(wú)菌EP管：1.5mL；無(wú)菌凍存管：2mL。

3.17  孔徑0.45μm～0.6μm，直徑47mm左右的無(wú)菌濾膜。

4   培養基和試劑

4.1  Preston肉湯：見(jiàn)附錄A中A.1。

4.2  緩沖蛋白胨水（BPW）：見(jiàn)附錄A中A.2。

4.3  mCCD瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.3。

4.4  Skirrow瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.4。

4.5  Karmali瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.5。

4.6  Preston瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.6。

4.7  哥倫比亞瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.7。

4.8  布氏肉湯：見(jiàn)附錄A中A.8。

4.9  氧化酶試劑：見(jiàn)附錄A中A.9。

4.10  馬尿酸鈉水解的檢測試劑：見(jiàn)附錄A中A.10。

4.11  吲哚乙酸酯紙片：見(jiàn)附錄A中A.11。

4.12  彎曲菌保存培養基：見(jiàn)附錄A中A.12。

4.13  彎曲菌運輸半固體培養基：見(jiàn)附錄A中A.13。

4.14  1mol/LNaOH溶液。

4.15  3%過(guò)氧化氫溶液。

4.16  生化鑒定試劑盒。

4.17  全自動(dòng)微生物鑒定系統生化鑒定卡。

4.18  彎曲菌PCR檢測試劑。

4.19  Tris-乙酸（TAE）、瓊脂糖、LoadingBuffer、溴化乙錠（EB）。

4.20  超純水。

4.21  無(wú)菌脫纖維羊血。

4.22  抗生素：頭孢哌酮、多粘菌素B硫酸鹽、利福平、兩性霉素B、萬(wàn)古霉素、甲氧芐啶。

 

第一法 定性檢驗

5   檢驗程序

    檢驗程序見(jiàn)圖1。

6   操作步驟

6.1   樣品處理

禽胴體：無(wú)菌條件下，將禽胴體放入合適容積的無(wú)菌自封袋中，加入Preston肉湯淹沒(méi)樣品（按每1kg樣品加入500mL Preston肉湯的比例），置于振蕩器上，5采集的樣品最好現場(chǎng)接種；如不能實(shí)現應將樣品低溫保存（4-7℃），但避免直接接觸冰塊。樣品應盡快送達實(shí)驗室檢測，以避免彎曲菌的損傷/死亡。以100 r/min的速度震蕩15 min，或反復揉搓禽胴體5 min（注意各個(gè)部位均要揉到）。無(wú)菌操作取出禽胴體，漂洗液進(jìn)行檢測。如果同時(shí)做多個(gè)檢驗項目，可以從禽胴體不同部位（脖子、胸、腿和肛門(mén)）處剪取檢驗需要量的肉和皮，均質(zhì)2 min，取該混合樣進(jìn)行其他項目的檢驗，剩余的禽胴體依照上法用Preston肉湯漂洗后取漂洗液進(jìn)行彎曲菌檢驗。

分割禽肉或畜肉：取分割肉1塊（大于100g）放入無(wú)菌自封袋中，加入適量Preston肉湯淹沒(méi)樣品（按每1kg樣品加入500 mLPreston肉湯的比例），以100r/min的速度震蕩15min,無(wú)菌操作取出肉塊，漂洗液進(jìn)行檢測。如果同時(shí)做多個(gè)檢驗項目，可以將多塊分割肉塊一起揉搓，剪取檢驗需要量進(jìn)行其他項目的檢驗，剩余的分割肉（大于100g）依照上法用Preston肉湯漂洗后取漂洗液進(jìn)行彎曲菌檢驗。

6.2  增菌

6.2.1 微需氧環(huán)境的建立：

抽氣換氣法（含有5%O2、10%CO2和85%N2的混合氣體）：將無(wú)菌吸管一端連接混合氣體鋼瓶，另一端插入含有樣品漂洗液的無(wú)菌自封袋中，密封袋口，打開(kāi)混合氣體鋼瓶開(kāi)關(guān)充氣至無(wú)菌袋鼓起，輕輕晃動(dòng)，使袋內的液體與混合氣體充分接觸，然后停止充氣，雙手按壓排出袋內混合氣體。以此法充氣排氣3次后再充入混合氣體，拔出吸管，立即密封袋口。

微需氧產(chǎn)氣袋法：將漂洗液倒入無(wú)菌瓶子內（將瓶子的蓋子旋松或以無(wú)菌牛皮紙包扎瓶口，以利于氣體的交換），將瓶子放入適當容積的微需氧培養裝置（厭氧盒里放置微需氧產(chǎn)氣袋，注意微需氧產(chǎn)氣袋產(chǎn)生氣體的量一定和厭氧盒子的容積相當）。

三氣培養箱等儀器法：按儀器說(shuō)明書(shū)調節溫度和氣體含量，待穩定后，放入含有漂洗液的瓶子（將瓶子的蓋子旋松或以無(wú)菌牛皮紙包扎瓶口，以利于氣體的交換）。

6.2.2 在微需氧條件下，42℃±1℃震蕩（25～100r/min）或靜止培養24h±2h。

6.3  分離培養

6.3.1 增菌液接種

將Karmali或mCCD瓊脂平板和Preston或Skirrow瓊脂平板在42℃±1℃烘干表面水分，將0.45μm~0.6μm無(wú)菌濾膜輕輕貼在平板的中間，不要產(chǎn)生空隙；取24h增菌液200μL~250μL滴加在濾膜上，室溫靜置45min~60min，待液體全部透過(guò)濾膜后，用無(wú)菌鑷子將濾膜輕輕揭下，棄去，翻轉平板，微需氧條件下42℃±1℃培養48 h±2 h。

6.3.2 可疑菌落的篩選

彎曲菌屬在Karmali選擇性平板上典型菌落形態(tài)一般有兩種，一種呈淺灰或灰白色、半透明而中心顏色較暗，圓形，光滑，中間凸起、針尖狀或小水珠狀， 直徑1mm～3mm，邊緣整齊、有光澤的單個(gè)菌落；另一種呈淺灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴狀，形狀常呈不規則圓盤(pán)狀，直徑2 mm～5mm的單個(gè)菌落。禽漂洗液中以第一種菌落形態(tài)較為常見(jiàn)。

mCCD瓊脂平板上的可疑菌落通常有光澤、潮濕、扁平，呈擴散生長(cháng)的傾向，直徑約為1mm～2 mm。

Skirrow瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤，呈沿接種線(xiàn)向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個(gè)菌落，直徑約為1 mm～2 mm，邊緣整齊、發(fā)亮。禽漂洗液中以第一種菌落形態(tài)較為常見(jiàn)。

Preston瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)一般也有兩種，一種呈淺灰白色或略顯淺粉白色，半透明、扁平或稍突起、濕潤、水滴狀，直徑2 mm～9mm不等的單個(gè)菌落；另一種呈淺灰色、半透明、圓形、光滑、隆起，針尖狀或小水珠狀，直徑1 mm～3mm，邊緣整齊、有光澤的單個(gè)菌落。兩種菌落形態(tài)均常見(jiàn)。

經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾培養后，一般平板上菌落都是純的彎曲菌菌落。

6.4  鑒定

6.4.1 彎曲菌屬的鑒定

挑取可疑菌落2～3個(gè)接種到哥倫比亞瓊脂平板上，微需氧條件下42℃培養24 h±2 h，按照6.4.1.1~6.4.1.5進(jìn)行鑒定，結果符合表1的可疑菌落確定為彎曲菌屬。

表1 彎曲菌屬的鑒定

項目	彎曲菌屬特性
形態(tài)觀(guān)察	革蘭氏陰性，菌體彎曲如小逗點(diǎn)狀，兩菌體的末 端相接時(shí)呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀a
動(dòng)力觀(guān)察	呈現螺旋狀運動(dòng)b
氧化酶試驗	陽(yáng)性
微需氧條件下25 ℃±1 ℃生長(cháng)試驗	不生長(cháng)
有氧條件下42 ℃±1 ℃生長(cháng)試驗	不生長(cháng)
a有些菌株的形態(tài)不典型。 b有些菌株的運動(dòng)不明顯。

6.4.1.1 形態(tài)觀(guān)察

對可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，復染時(shí)使用0.5%的苯酚品紅溶液。彎曲菌為革蘭氏陰性，菌體彎曲如小逗點(diǎn)狀，兩菌體的末端相接時(shí)呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。

6.4.1.2 動(dòng)力觀(guān)察

挑取可疑菌落用1mL布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀(guān)察運動(dòng)狀態(tài)。彎曲菌屬呈現螺旋狀運動(dòng)。

6.4.1.3 氧化酶試驗

使用無(wú)菌棉簽蘸取可疑菌落，將氧化酶試劑直接滴加到沾有菌的棉簽上，如果在10 s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽(yáng)性。彎曲菌屬為陽(yáng)性。

6.4.1.4 微需氧條件下25℃±1℃生長(cháng)試驗

挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下25℃±1℃培養44 h±4 h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。彎曲菌屬不生長(cháng)。

6.4.1.5 有氧條件下42℃±1℃生長(cháng)試驗

挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下42 ℃±1℃培養44 h±4 h，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。彎曲菌屬不生長(cháng)。

6.4.2  空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定

6.4.2.1 過(guò)氧化氫酶試驗

挑取菌落，加到干凈玻片上的3％過(guò)氧化氫溶液中，如果在30 s內出現氣泡則判定結果為陽(yáng)性�？漳c彎曲菌、結腸彎曲菌和海鷗彎曲菌為陽(yáng)性。

6.4.2.2 馬尿酸鹽水解試驗

挑取菌落（菌量要大），加到盛有0.4 mL 1％馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液。

混合均勻后在36℃±1℃水浴中溫育2 h或36℃±1℃培養箱中溫育4 h。加入

0.2 mL茚三酮溶液，在36℃±1℃的水浴或培養箱中再溫育10 min后判讀結果。若出現深紫色則為陽(yáng)性；若出現淡紫色或沒(méi)有顏色變化則為陰性。

6.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗6

挑取菌落（菌量要大）至羥基吲哚醋酸鹽紙片上，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，則在5 min～10 min內出現深藍色；若無(wú)顏色變化則表示沒(méi)有發(fā)生水解�？漳c彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定結果見(jiàn)表2。

表2 空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定

6.4.2.4 替代實(shí)驗

對于確定為彎曲菌屬的菌落，可以使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統來(lái)替代6.4.2.1～6.4.2.3的鑒定。

6.4.3  彎曲菌的PCR鑒定（可選項目）

按下列方法進(jìn)行PCR鑒定。也可以使用商品化的試劑盒對可疑彎曲菌純培養物進(jìn)行鑒定，試劑盒使用前需經(jīng)過(guò)驗證合格，具體操作見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

6.4.3.1 模板DNA的制備

無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌苔，在200μL無(wú)菌超純水中混勻（菌懸液呈肉眼可見(jiàn)的微混濁狀即可，不宜過(guò)度混濁），于100℃水浴中加熱10 min后，13000×g離心2min，上清液即為制備好的DNA模板，將其轉于另一無(wú)菌離心管中備用。

6.4.3.2 引物序列和目的基因片段見(jiàn)表3。

表3 五種彎曲菌特征基因序列和PCR片段大小

檢測基因	引物序列	片段大小/bp
23S rRNA (彎曲菌)	23S-F: 5’-TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG-3’ 23S-R: 5’-ATCAATTAACCTTCGAGCACCG-3’	650
hipO (空腸彎曲菌)	CJ-F: 5’-ACTTCTTTATTGCTTGCTGC-3’ CJ-R: 5’-GCCACAACAAGTAAAGAAGC-3’	323
glyA (結腸彎曲菌)	CC-F: 5’-GTAAAACCAAAGCTTATCGTG-3’ CC-R: 5’-TCCAGCAATGTGTGCAATG-3’	126
glyA (海鷗彎曲菌)	CL-F: 5’-TAGAGAGATAGCAAAAGAGA-3’ CL-R: 5’-TACACATAATAATCCCACCC-3’	251
glyA (烏普薩拉彎曲菌)	CU-F: 5’-AATTGAAACTCTTGCTATCC-3’ CU-R: 5’-TCATACATTTTACCCGAGCT-3’	204
sapA12 (胎兒彎曲菌)	CF-F: 5’-GCAAATATAAATGTAAGCGG-3’ CF-R: 5’-TGCAGCGGCCCCACCT-3’	435

6.4.3.3 反應體系見(jiàn)表4。

表4 PCR反應體系組成

6.4.3.4 PCR反應條件

95℃預變性6 min后，按照95℃30s，59℃30s，72℃30 s進(jìn)行30個(gè)

循環(huán)，然后72℃延伸7 min。產(chǎn)物當時(shí)不能檢測時(shí)4℃保存。

6.4.3.5 PCR檢測

分別取10 μL PCR產(chǎn)物，與2 μL 6×loading buffer混勻后，加樣于點(diǎn)樣孔中。5 v/cm，電泳30 min～40 min。與對照相比，若出現目的條帶則為陽(yáng)性。

7   結果報告

綜合以上試驗結果，報告樣品中檢出空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌或/和胎兒彎曲菌。

如果沒(méi)有可疑菌落、或可疑菌落鑒定后不是空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌者或/和胎兒彎曲菌，報告樣品中未檢出空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌或/和胎兒彎曲菌。

 

第二法 平板計數法

8   檢驗程序

彎曲菌平板計數程序見(jiàn)圖2：

9  操作步驟樣品處理

9.1.1 禽胴體：無(wú)菌條件下，將禽胴體放入合適容積的無(wú)菌自封袋中，加入緩沖蛋白胨水（以每1kg樣品加入500mL緩沖蛋白胨水的比例），置于振蕩器上，以100r/min的速度震蕩15min，或反復揉搓禽胴體5 min（注意各個(gè)部位均要揉到）。無(wú)菌操作取出禽胴體，漂洗液作為原液進(jìn)行檢測。如果同時(shí)做多個(gè)檢驗項目，可以從禽胴體不同部位（脖子、胸、腿和肛門(mén)）處剪取檢驗需要量的肉和皮，均質(zhì)2 min，取該混合樣進(jìn)行其他項目的檢驗，剩余的禽胴體依照上法用緩沖蛋白胨水漂洗后取漂洗液作為原液進(jìn)行彎曲菌檢測。

9.1.2 分割的肉塊：取分割肉適量放入無(wú)菌自封袋中，加入緩沖蛋白胨水（以每1kg樣品加入500 mL緩沖蛋白胨水的比例），以100 r/min的速度震蕩15 min,無(wú)菌操作取出肉塊，漂洗液作為原液進(jìn)行檢測。如果同時(shí)做多個(gè)檢驗項目，可以將多塊分割肉塊一起揉搓，從不同肉塊上剪取檢驗需要量進(jìn)行其他項目的檢測，剩余的分割肉依照上法用緩沖蛋白胨水漂洗后，取漂洗液作為原液進(jìn)行彎曲菌檢測。

9.1.3 用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取9.1.1或9.1.2漂洗液，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液（生理鹽水或pH7.2磷酸鹽緩沖液）的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

9.1.4 按9.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無(wú)菌吸管或吸頭。

9.2  樣品的接種和培養

根據對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（一般選擇原液、10倍、100倍或1000倍稀釋液），每個(gè)稀釋度各100μL，立即涂布于Karmali選擇性瓊脂平板上，每個(gè)稀釋度每種平板做2個(gè)平行，于42℃±1℃微需氧環(huán)境（5%O2、10%CO2、85%N2）培養48 h±2 h。

9.3  可疑彎曲菌菌落形態(tài)

彎曲菌屬在Karmali選擇性平板上典型菌落形態(tài)一般有兩種，一種呈淺灰或灰白色、半透明而中心顏色較暗，圓形，光滑，中間凸起、針尖狀或小水珠狀，直徑13mm；邊緣整齊、有光澤的單個(gè)菌落；另一種呈淺灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴狀，形狀常呈不規則圓盤(pán)狀，直徑2 mm～5 mm的單個(gè)菌落。雞漂洗液中以第一種菌落形態(tài)較為常見(jiàn)。

9.4  菌落計數

9.4.1 若Karmali平板上未出現符合上述特征的可疑菌落，則樣品中彎曲菌為陰性。

9.4.2 培養后，觀(guān)察平板上出現的所有可疑菌落數，菌落形態(tài)通常為單一類(lèi)別，有時(shí)候可能出現多種菌落形態(tài)。選擇平均可疑菌落數15-150CFU/板的稀釋度進(jìn)行計數。

9.4.3 如果所有稀釋度的平板上的平均可疑菌落數均不在15-150CFU/板范圍內，其中一部分小于15CFU或大于150CFU，則選擇平均可疑菌落數最接近15或150的稀釋度，且菌落分離度好的平板進(jìn)行計數。

9.4.4 如果所有稀釋度平板可疑菌落數均>150CFU/板，則選擇稀釋倍數最大、菌落分離度好的平板進(jìn)行計數。

9.5  彎曲菌純化

9.5.1 用接種針從平均可疑菌落數15-150CFU/板的同一稀釋度的兩塊平板上共挑取至少5個(gè)可疑菌落（可疑菌落總數不足5個(gè)時(shí)，全部挑�。�，劃線(xiàn)接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，于42℃±1℃微需氧環(huán)境中培養48h±2h。

9.5.2 如果最高稀釋度平板上的可疑彎曲菌平均菌落數>50CFU/板，則從該稀釋度中挑取用于鑒定的菌落數應為平均菌落數的10%（最多10個(gè)菌落）。

9.5.3 如果同一種類(lèi)型的菌落鑒定結果不一致（如菌落表型特征一樣但鑒定結果不同），再多挑幾個(gè)該種類(lèi)型的菌落（總數可達到10個(gè)）進(jìn)行純化。

9.6  可疑彎曲菌菌落的鑒定

使用生化鑒定或PCR方法對可疑彎曲菌菌落進(jìn)行鑒定，具體操作見(jiàn)6.4鑒定。

9.7  菌落計數和結果計算

依據生化鑒定或PCR鑒定結果，計算每塊選擇性平板上彎曲菌的實(shí)際菌落數。

計算公式如下：

每塊平板上彎曲菌實(shí)際菌落數=兩塊平板上可疑菌落數的平均數×（鑒定為彎曲菌的陽(yáng)性菌落數/挑取的可疑菌落數）

例如：同一稀釋度的兩塊Karmali平板上分別有100CFU和85CFU可疑菌落，挑取5個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定后，結果顯示4個(gè)菌落為彎曲菌，則陽(yáng)性率為80%，則該稀釋度下彎曲菌的實(shí)際菌落數為：（100+85）/2′80%=74CFU。根據稀釋度和接種量計算每克樣品中的彎曲菌數量：如10-1稀釋度平板上彎曲菌平均菌落數為74CFU，則彎曲菌數量（CFU/g）= 74′10′（1/0.1）′（500/1000）注：74：10-1稀釋度平板上彎曲菌平均菌落數為74；10：稀釋倍數（10-1稀釋度）；0.1：每平板上涂布樣液量0.1mL（100μL）； 500/1000：500mL緩沖蛋白胨水/樣品重量1 kg。

10   報告

根據9.7計算結果，報告每g樣品中某種彎曲菌或幾種彎曲菌的數量（小于100CFU，按“四舍五入”原則修約后以整數報告；大于或等于100CFU，以10的指數形式來(lái)表示，保留2位有效數字），以CFU/g為單位報告；如果平板上均無(wú)可疑菌落，則以小于1乘以最低稀釋倍數乘以5報告。

11   菌株的保存和運輸

11.1  菌株保存

將經(jīng)過(guò)鑒定的菌株純化于哥倫比亞瓊脂平板上，42 ℃±1 ℃微需氧環(huán)境中培養18 h～24 h后，無(wú)菌棉拭子將哥倫比亞瓊脂平板上的所有菌苔全部擦拭后，均勻懸浮于盛有彎曲菌保存培養基的凍存管中于4℃冰箱放置30 min，然后貯于-80℃凍存。

11.2  菌株運輸

運送前，將凍存管從-80℃冰箱中取出，用接種環(huán)挑取少許凍存液，劃線(xiàn)接種于1塊哥倫比亞瓊脂平板上，42℃±1℃微需氧環(huán)境中培養48 h后，用無(wú)菌接種環(huán)將所有菌苔全部刮下，轉種于含5%裂解羊血的彎曲菌運輸半固體培養基中，擰緊管蓋后，置于裝有冰塊的保溫裝置中，運輸時(shí)間不宜超過(guò)48 h。

 

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