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1 方法來(lái)源
GB 4789.29-xxxx《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢驗》。
2 適用范圍
本程序規定了食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的檢驗方法。
3 設備和材料
3.1 實(shí)驗室常規滅菌設備。
3.2 冰箱：2℃～8℃、-20℃～-30℃。
3.3 恒溫培養箱：26℃±1℃、36℃±1℃。
3.4 恒溫水浴鍋：46℃±1℃。
3.5 顯微鏡：10倍～100倍。
3.6 均質(zhì)器。
3.7 離心機：3000r/min。
3.8 電子天平：感量0.1g。
3.9 比濁計。
3.10 錐形瓶：容量100 mL、500 mL。
3.11 無(wú)菌培養皿：直徑90mm、直徑150mm。
3.12 無(wú)菌透明玻璃紙、濾紙。
3.13 無(wú)菌灌胃器：1mL。
3.14 微生物生化鑒定系統。
3.15 小鼠：18g～20g，每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。
4 培養基和試劑
4.1 GVC增菌液：見(jiàn)A.1。
4.2 改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（mPDA）：見(jiàn)A.2。
4.3 PCFA培養基：見(jiàn)A.3。
4.4 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：見(jiàn)A.2.1。
4.5 馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂：見(jiàn)A.4。
4.6 卵黃瓊脂：見(jiàn)A.5。
4.7 革蘭氏染色液：見(jiàn)A.6。
4.8 氧化酶試劑：見(jiàn)A.7。
4.9 Hugh-Leifson培養基（O/F試驗用）：見(jiàn)A.8。
4.10 蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用）：見(jiàn)A.9。
4.11 緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR和VP試驗用）：見(jiàn)A.10。
4.12 西蒙氏檸檬酸鹽培養基：見(jiàn)A.13。
4.13 苯丙氨酸培養基：見(jiàn)A.14。
4.14 糖發(fā)酵管：見(jiàn)A.15。
4.15 半固體瓊脂：見(jiàn)A.16。
4.16 抗O多價(jià)血清、型特異性因子血清（O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型）。
4.17 生化鑒定試劑盒。
5 檢驗程序
唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢驗程序見(jiàn)圖1。
6 操作步驟
6.1 樣品處理
無(wú)菌操作稱(chēng)取25g（mL）樣品，置入盛有225mLGVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中（鮮銀耳樣品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mLGVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中），用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min；或置入盛有225mLGVC增菌液的無(wú)菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min；若樣品為液態(tài)，振蕩混勻。
6.2 增菌
將上述樣品增菌液置36℃±1℃培養20h～24h。
6.3 分離
用直徑3mm的接種環(huán)取增菌液一環(huán)，分別劃線(xiàn)接種于mPDA平板和PCFA平板，36℃±1℃培養24 h～48 h。觀(guān)察各個(gè)平板上生長(cháng)的菌落，各個(gè)平板上菌落特征見(jiàn)表1。
表1 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌在不同分離平板上的菌落特征
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培養基 |
菌落特征 |
|
mPDA 平板 |
培養24 h后，菌落1 mm～2 mm，紫色，光滑、濕潤、邊緣整齊。培 養48 h后，部分菌落中心可有凸起呈草帽狀。 |
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PCFA 平板 |
培養24h后，菌落0.5mm～1mm，灰白色，光滑、濕潤、邊緣整齊。 |
|
卵黃瓊脂平板 |
培養24 h后，菌落2 mm～3mm，表面光滑、濕潤，培養48 h后，菌 落周?chē)纬扇榘咨鞚岘h(huán)，斜射光下可見(jiàn)菌落及周?chē)囵B基表面呈虹彩現象。 |
6.4 初篩試驗
自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落（低于5個(gè)全選），分區劃線(xiàn)接種于卵黃瓊脂平板，36℃±1℃培養。挑取培養18～24 h的菌落進(jìn)行革蘭氏染色及氧化酶試驗。對于革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性的菌繼續培養至48 h±2 h，對于卵磷脂酶陽(yáng)性，帶有虹彩環(huán)的單個(gè)菌落，接種PDA平板，36℃
±1℃培養24 h±2 h。
6.5 生化試驗
從純培養的PDA平板上挑取菌苔進(jìn)行生化鑒定。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌生化特征見(jiàn)表2�？蛇x擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統。
表2 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌生化特征
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生化試驗 |
特 征 |
|
O/F 試驗（氧化型） |
+ |
|
氧化： |
|
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葡萄糖 |
+ |
|
果糖 |
+ |
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木糖 |
+ |
|
半乳糖 |
+ |
|
蔗糖 |
- |
|
阿拉伯糖 |
+ |
|
甘露醇 |
+ |
|
側金盞花醇 |
+ |
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肌醇 |
+ |
|
衛茅醇 |
+ |
|
動(dòng)力 |
+ |
|
卵磷脂酶 |
+ |
|
氧化酶 |
- |
|
尿素 |
+ |
|
明膠液化 |
+ |
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硝酸鹽還原 |
+ |
|
檸檬酸鹽利用 |
+ |
|
精氨酸 |
+ |
|
石蕊牛乳 |
+ |
|
靛基質(zhì) |
- |
|
V-P |
- |
|
MR |
- |
|
苯丙氨酸脫氨酶 |
- |
|
H2S 產(chǎn)生 |
- |
|
注：＋表示陽(yáng)性;－表示陰性。 |
|
6.6 血清學(xué)分型鑒定（可選擇項）
6.6.1 菌體抗原的制備
將PDA平板36℃±1℃培養24 h±2 h 的培養物用無(wú)菌生理鹽水洗下，沸水浴（100 ℃）2h，3000r/min10min離心棄上清液，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋至5×108～109 CFU/mL菌懸液，作為凝集試驗用抗原。
6.6.2 菌體抗原的鑒定
用多價(jià)血清做玻片凝集試驗，同時(shí)用生理鹽水做對照。與多價(jià)血清凝集者， 依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做試管凝集試驗。根據試驗結果，判定菌體抗原型。在生理鹽水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能與以上血清凝集者，需保留菌株做進(jìn)一步鑒定。
6.7 毒性試驗
6.7.1 產(chǎn)毒培養
將初步鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的菌株接種PDA平板，36℃±1℃， 培養24 h±2 h，用滅菌接種環(huán)刮取適量菌苔，加到3mL無(wú)菌生理鹽水的試管中， 配成1麥氏濃度（McFarland，MCF）的菌懸液（約為108CFU/mL），用無(wú)菌吸管吸取0.5mL，滴在鋪好無(wú)菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板上，用無(wú)菌L棒涂布均勻，26℃±1℃培養5 d。取下帶菌的玻璃紙，將半固體平板置于100℃流動(dòng)蒸汽滅菌30 min。室溫冷卻后，置-20℃～-30℃冰箱過(guò)夜。將冰凍好的半固體平板置室溫融化，用無(wú)菌吸管吸出凍融液，經(jīng)濾紙過(guò)濾至無(wú)菌試管或錐形瓶中（此為毒素粗提液），4℃避光保存。
同時(shí)，將未接種菌苔、鋪好無(wú)菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板作為陰性對照，按照同樣的試驗方法制備陰性對照粗提液，4℃避光保存。
6.7.2 毒力測定
取毒素粗提液或經(jīng)100℃水浴蒸發(fā)后的5～10倍濃縮液，灌胃小鼠3只，每只 0.5 mL，觀(guān)察至7 d。若菌株產(chǎn)生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20 min～24 h內發(fā)病。主要癥狀為豎毛、萎糜不振、躁動(dòng)，繼而行步蹣跚、肢體麻痹、癱軟、抽搐，呈角弓反張狀，呼吸急促、死亡。
取陰性對照粗提液或經(jīng)100℃水浴蒸發(fā)后的5～10倍濃縮液，灌胃小鼠3只， 每只0.5 mL，觀(guān)察至7 d。小鼠應健康存活。
6.7.3 米酵菌酸測定
毒力測定實(shí)驗陽(yáng)性時(shí)，分別取毒素粗提液，陰性對照粗提液，按照GB 5009.189執行。
7 結果報告
生化試驗符合且毒性試驗陽(yáng)性,報告檢出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）；生化試驗和毒性試驗有一項不符合,報告未檢出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）。
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