梭狀芽孢桿菌檢驗標準操作程序

1   方法來(lái)源

    《食品及土壤中產(chǎn)肉毒毒素梭狀芽孢桿菌檢測實(shí)驗室操作流程》和《嬰兒食品、生物樣品及環(huán)境中梭狀芽孢桿菌檢測實(shí)驗室操作流程》

    GB 4789.12-2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

 

2   適用范圍

    本程序規定了食品中梭狀芽孢桿菌（Clostridium Prazmowski）的檢驗方法。本程序適用于食品中梭狀芽孢桿菌（Clostridium Prazmowski）的定性檢驗，包括丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）、艱難梭菌（Clostridiumdifficile）、生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）、肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）、巴氏梭菌（Clostridiumbarati）等。

 

3   設備和材料

   除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

3.1  恒溫培養箱（4～50℃±1℃）。

3.2  厭氧裝置（厭氧罐、厭氧箱等）。

3.3  生物安全柜。

3.4  比濁儀。

3.5  冰箱（0～4℃、-20℃及-80℃）。

3.6  離心機（0～20000rpm）。

3.7  樣品均質(zhì)器。

3.8  渦旋器。

3.9  電泳儀。

3.10  PCR儀。

3.11  恒溫振蕩器。

3.12  電熱恒溫水浴箱（10℃～100℃）。

3.13  電子天平（精度0.01g及0.0001g）。

3.14  熒光PCR儀。

3.15  高壓滅菌鍋。

3.16  顯微鏡。

3.17  滅菌吸管。

3.18  PCR管。

3.19  無(wú)菌錐形瓶。

3.20  無(wú)菌培養皿：直徑90mm。

3.21  無(wú)菌離心管。

3.22  無(wú)菌試管。

3.23  載玻片。

3.24  酒精燈。

3.25  pH計或pH比色管或精密pH試紙。

4   培養基和試劑

4.1  明膠磷酸鹽緩沖液（GBS）：見(jiàn)附錄A中A.1。

4.2  庖肉培養基（CMM）：見(jiàn)附錄A中A.2。

4.3  胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT)：見(jiàn)附錄A中A.3。

4.4  哥倫比亞血瓊脂培養基：見(jiàn)附錄A中A.4。

4.5  LB肉湯培養基。

4.6  LB瓊脂培養基。

4.7  pMD19-Tvectorcloningkit。

4.8  JM109感受態(tài)細胞。

4.9  2×PfuPCR MasterMix。

4.10  氨芐青霉素。

4.11  IPTG。

4.12  X-Gal。

4.13  膠回收試劑盒。

4.14  DNA提取試劑盒。

4.15  革蘭氏染液：見(jiàn)附錄A中A.5。

4.16  標準菌株：丁酸梭菌CICC10390生孢梭菌CICC10385。

 

5   定性檢驗

6   操作步驟

6.1  增菌培養

接種前，先將CMM和TPGY培養基沸水中隔水煮沸10min-15min后，迅速放入冰或冰水浴中快速冷卻。

取混勻后的食品樣品25g于無(wú)菌均質(zhì)袋內，加入35mL明膠磷酸鹽緩沖液（1:1.5稀釋?zhuān)�緩沖液加入比例可根據具體樣品性狀進(jìn)行適量增減，原則上加入的稀釋液體積越少越好），于勻漿器中充分混勻后，取2mL樣液分別接種CMM和TPGYT培養基，每種培養基接種2管。若為風(fēng)干樣品，則加入明膠磷酸鹽緩沖液室溫浸泡60min后再進(jìn)行勻漿及接種。

6.2  培養物檢查

培養5天后，檢查培養物的濁度、產(chǎn)氣、肉粒消化及氣味。如果培養5天的增菌液中沒(méi)有細菌生長(cháng)，則應繼續培養10天。

6.3  菌的分離

6.3.1 增菌液前處理

取1-2mL增菌液于5mL滅菌離心管內，加入等量的無(wú)水乙醇，充分混勻， 室溫靜置1h。用接種環(huán)取經(jīng)無(wú)水乙醇處理后的增菌液接種至哥倫比亞血瓊脂平板內，35±1℃厭氧培養48-72h，培養期間嚴禁破壞厭氧環(huán)境。

6.3.2 典型菌落挑選

典型梭狀芽孢桿菌在哥倫比亞血瓊脂培養基上菌落多為白色或半透明，扁平、粗糙、蔓延根狀生長(cháng)或輪狀生長(cháng)，難刮除菌落；典型肉毒梭菌多為扁平圓形菌落，半透明，蔓延輪狀生長(cháng)，邊緣整齊或不整齊，部分菌落可在短時(shí)間內蔓延長(cháng)滿(mǎn)整個(gè)平板。在分離平板上選擇5個(gè)分離良好的典型菌落，分別再次接種哥倫比亞血瓊脂平板，35±1℃厭氧培養48-72h。

6.4  革蘭氏染色鏡檢

挑取純培養后的細菌菌落，涂片革蘭氏染色后鏡檢，觀(guān)察菌落形態(tài)，并注意是否有典型的梭狀菌、是否形成芽孢以及芽孢的位置等。同時(shí)對革蘭氏陽(yáng)性的純培養物進(jìn)行鑒定。

6.5  結果鑒定

6.5.1 生化鑒定

選擇微生物全自動(dòng)生化鑒定系統，VITEK 2 ANC TEST KIT鑒定卡，按操作說(shuō)明進(jìn)行鑒定。因人工判讀誤差較大，正確率低，不推薦使用API20A或Crystal Anaerobe ID 等商品化試劑條鑒定。

6.5.2 熒光PCR檢測

表1 梭菌屬鑒定用引物和探針序列

引物和探針	序列（5’- 3’）
上游引物	GCTCGTGTCGTGAGATGTT
下游引物	CTCRYTAGAGTSCTCAACYWAA
探針	FAM- AAYAAYAAGGGTTGCGCTCGTTGC- BQ1
注：所有引物和探針均配置成10%μmol/L 濃度后使用。

 

6.5.2.1 挑取革蘭氏染色呈陽(yáng)性梭狀芽孢桿菌的二次傳代純培養后的新鮮菌落約20個(gè)，懸浮于1mL滅菌蒸餾水內，100℃煮沸10min后置于冰或冰水浴中迅速冷卻，10000r/min離心2min 后備用。

6.5.2.2 每個(gè)反應的總體積為25μl，體系組分為：Probemastermix12.5μl，上游引物和下游引物各0.8μl，探針0.5μl，去除DNA酶和RNA酶的無(wú)菌水5.4μl，模板DNA5μl。反應條件：95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃20s，60℃30s，72℃30s，45個(gè)循環(huán)。

6.5.2.3 判定標準：當空白對照Ct≥40，陰性對照Ct≥40，陽(yáng)性對照Ct＜35，滿(mǎn)足以上條件者檢測結果 方有效。若樣品Ct＜35，則判定樣品中含有梭狀芽孢桿菌屬；若樣品Ct≥40，則判定樣品中不含梭狀芽孢桿菌屬；若35≤Ct＜40，需對樣品進(jìn)行重復實(shí)驗，如重復結果仍然為35≤Ct＜40，則判定樣品中不含有梭狀芽孢桿菌屬。

6.5.2.4 熒光PCR檢測鑒定梭菌屬陽(yáng)性的菌株繼續采用其它鑒定手段進(jìn)一步鑒定到種，也可用商品化良潤梭菌菌種鑒定試劑盒（PCR-探針?lè )ǎ┻M(jìn)行梭狀芽胞桿菌熒光PCR 鑒定。

6.5.3  微生物飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測

運用飛行時(shí)間質(zhì)譜對革蘭氏染色陽(yáng)性的純培養物進(jìn)行鑒定。注：飛行時(shí)間質(zhì)譜無(wú)法對肉毒梭菌進(jìn)行鑒定

6.5.4  16sRNA測序

6.5.4.1 細菌DNA提取

按照革蘭氏陽(yáng)性菌DNA試劑盒要求提取DNA。

6.5.4.2 基因擴增

通用引物對細菌16S RNA進(jìn)行PCR擴增，陽(yáng)性菌株電泳后按照膠回收試劑盒要求切膠回收。實(shí)驗應設陰性及空白對照。引物及PCR擴增條件分離見(jiàn)表2、表3、表4。

表2 16 SRNA PCR反應引物序列

引物名稱(chēng)	引物序列	片段大小/bp
FD1	5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’	1500bp
RP2	5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’

6.5.4.3  16SRNAPCR產(chǎn)物克隆

6.5.4.3.1 PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒連接：按照表5加入各反應物，16℃反應30分鐘以上。

  表5 PCR產(chǎn)物連接

試劑	加入量
pMD19-T vector	1μL
DNA 模板	2μL
ddH2O	2μL
Solution I	5μL
總體積	10μL

 

6.5.4.3.2 連接產(chǎn)物的轉化

全量（10μL）加入至100μL JM109感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。加入890μL SOC培養基，36±1℃振蕩培養60分鐘。

6.5.4.3.3 克隆產(chǎn)物篩選：

在含100μg/mL氨芐西林的LB瓊脂培養基平皿上加入24mg/mL的IPTG 25μL，20mg/mL的X-Gal 50μL，無(wú)菌涂布均勻后避光保存備用。取6.6.3.2制備好的菌液100μL的菌液涂布于處理后的LB瓊脂培養基平皿上，36±1℃避光培養16-18h后，挑取瓊脂平板上的白色菌落接種于含有氨芐西林的LB肉湯，36±1℃振蕩培養6h。

6.5.4.3.4 克隆產(chǎn)物PCR 確認

引物及PCR擴增條件見(jiàn)表6、表7及表8，其中反應總體積可根據實(shí)際需要進(jìn)行調整。實(shí)驗應設陰性及空白對照。

表6 PCR反應的引物序列

 

表7 PCR反應體系

表8 PCR反應條件

預變性	擴增	循環(huán)數	延伸
95℃，5min	95℃，1min	30	72℃，8min
	55℃，1min
	72℃，1.5min

6.5.4.4 將經(jīng)PCR確認克隆成功菌株進(jìn)行測序，并比對基因序列。

注：16sRNA克隆測序結果不能將生孢梭菌和肉毒梭菌進(jìn)行準確區分，因為生孢梭菌和A型、B型肉毒梭菌16sRNA序列有99%以上同源。

6.5.5  肉毒梭菌鑒定

疑似為肉毒梭菌的菌株需要需要檢測毒素基因或進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗確認。

6.5.5.1 肉毒毒素基因PCR檢測

6.5.5.1.1細菌DNA提�。喊凑崭锾m氏陽(yáng)性菌DNA試劑盒要求提取DNA。

6.5.5.1.2 基因擴增：采用針對A、B、E、F型肉毒梭菌肉毒毒素基因設計的通用引物進(jìn)行PCR擴增。引物及PCR反應體系和參數見(jiàn)表8、表9和表10。反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進(jìn)行適當的調整。PCR檢測時(shí)反應體系應設置陽(yáng)性對照、陰性對照和空白對照。

表9 肉毒毒素基因PCR檢測的引物序列

表10 肉毒毒素基因PCR檢測的反應體系

表11 肉毒毒素基因PCR檢測的反應參數

6.5.5.1.3  結果分析：電泳檢測結果用凝膠成像系統記錄。陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽(yáng)性對照出現預期大小的擴增條帶，待測樣品出現預期大小的擴增條帶，判定為PCR結果陽(yáng)性；待測樣品未出現預期大小的擴增條帶，判定PCR結果為陰性。實(shí)驗中設置的陰性對照、空白對照和陽(yáng)性對照PCR檢測結果應符合上述情況。否則，任一種對照如果出現非上述正常結果，應重做實(shí)驗。 也可用商品化良潤梭菌菌種鑒定試劑盒（PCR-探針?lè )ǎ┻M(jìn)行肉毒梭菌熒光 PCR鑒定。

6.5.5.2   動(dòng)物實(shí)驗

按照GB4789.12-2016國標方法進(jìn)行肉毒毒素檢測鑒定肉毒梭菌。

7  菌株保存

短期（1個(gè)月）保存：可保存于CMM肉湯培養基內。取純化后的菌落接種于CMM肉湯培養基內，于35±1℃厭氧培養48h-72h，待CMM肉湯培養基出現肉眼可見(jiàn)混濁后，于2-4℃冰箱保存。

中長(cháng)期（1-2年）保存：可保存于磁珠保存管內。取純化后的菌落接種于哥倫比亞血平板培養基內，于35±1℃厭氧培養48h-72h，用無(wú)菌棉簽刮取適量菌落于磁珠管內混勻，吸除多余液體，于-80℃冰箱保存。為保證菌株的高存活率，建議使用進(jìn)口磁珠。

長(cháng)期（2-10年）保存：將菌株冷凍干燥后冷藏保存。取純化后的菌落接種于哥倫比亞血平板培養基內，于35±1℃厭氧培養48h-72h后，向每個(gè)平板中加入1mL脫脂奶粉配成的凍存液，用L涂布棒刮取平板上菌落于凍存液內，繼而吸取200uL放入凍干瓶?jì)�，凍干后�?-4℃冰箱保存。

8  結果與報告

8.1結果判定：依據6.5.1、6.5.2，6.5.3，6.5.4對梭狀芽孢桿菌進(jìn)行判定。

8.2結果報告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出梭狀芽孢桿菌。

9  注意事項

9.1 樣品稀釋?zhuān)河妹髂z磷酸鹽緩沖液稀釋樣品時(shí)，原則上稀釋到適宜于接種即可。

9.2 由于牛肉粒會(huì )吸收部分水分，為了獲取更多的增菌培養液，庖肉培養基制備時(shí)牛肉粒不宜放入過(guò)多。

9.3 隔水煮沸增菌培養基時(shí)，應在試管內的培養基沸騰后開(kāi)始計時(shí)10-15min。向含有增菌液的試管內接種樣品時(shí)，盡量靠近試管底部接種，并避免接入氣泡和攪動(dòng)。

9.4 為便于培養期間觀(guān)察，建議盡量用透明厭氧裝置培養，培養期間嚴禁打開(kāi)厭氧裝置破壞厭氧環(huán)境。

9.5 為了檢驗培養環(huán)境的厭氧情況，培養過(guò)程中應在厭氧裝置中放入厭氧指示劑。

9.6 增菌過(guò)程中加入液體石蠟是為了保證提供充分的厭氧環(huán)境，若培養過(guò)程中使用的厭氧裝置密閉性好也可以不加液體石蠟封閉。取增菌液劃平板時(shí)應小心用移液器慢慢吸出增菌液于另一容器內再劃線(xiàn)，并盡可能去除液體石蠟，不推薦使用接種環(huán)直接從用液體石蠟封閉的增菌液中取樣直接劃平板。

 

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