創(chuàng )傷弧菌檢驗標準操作程序

1  方法來(lái)源

   FDA/BAM   Chapter 9   Vibrio2004

2  適用范圍

   本程序規定了食品中創(chuàng )傷弧菌（Vibrio vulnificus）的檢驗方法。本程序適用于食品中創(chuàng )傷弧菌的檢驗。

3  設備和材料

   除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。

3.1  恒溫培養箱：36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。

3.2  冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃。

3.3  恒溫水浴箱：36℃±1℃。

3.4  均質(zhì)器或無(wú)菌乳缽。

3.5  天平：感量0.1 g。

3.6  無(wú)菌試管：18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.7  無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

3.8  無(wú)菌錐形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。

3.9  無(wú)菌培養皿：直徑90mm。

3.10  無(wú)菌手術(shù)剪、鑷子。

3.11  PCR儀。

3.12  電泳裝置。

3.13  凝膠分析成像系統。

3.14  PCR超凈工作臺。

3.15  高速臺式離心機（15000r/min）。

3.16  微量可調移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相應吸頭。

4  培養基和試劑

4.1  3％氯化鈉堿性蛋白胨水：見(jiàn)附錄A中A.1。

4.2  改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.2。

4.3  纖維二糖-多粘菌素E（CC）瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.3。

4.4  3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.4。

4.5  3％氯化鈉三糖鐵瓊脂：見(jiàn)附錄A中A.5。

4.6  嗜鹽性試驗培養基：見(jiàn)附錄A中A.6。

4.7  3％氯化鈉賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養基：見(jiàn)附錄A中A.7。

4.8  3％氯化鈉MR-VP培養基：見(jiàn)附錄A中A.8。

4.9  3％氯化鈉溶液：見(jiàn)附錄A中A.9。

4.10 氧化酶試劑：見(jiàn)附錄A中A.10。

4.11 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.11。

4.12 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）試劑：見(jiàn)附錄A中A.12。

4.13 Voges-Proskauer（V-P）試劑：見(jiàn)附錄A中A.13。

4.14 生化鑒定試劑盒。

4.15 DNA提取液。

4.16 6×上樣緩沖液。

4.17 0.5×TBE。

4.18 瓊脂糖。

4.19 DNA分子量標記物（100 bp-1000 bp）。

4.20 PCR反應配套試劑。

第一法 定性檢驗

5  檢驗程序

創(chuàng )傷弧菌檢驗程序見(jiàn)圖1。

6  操作步驟  

6.1  樣品制備

6.1.1 非冷凍樣品采集后應立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應在45 ℃以下不超過(guò)15min或在2 ℃～5 ℃不超過(guò)18 h解凍。

6.1.2 魚(yú)類(lèi)和頭足類(lèi)動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。貝類(lèi)取全部?jì)热菸�，包括貝肉和體液；甲殼類(lèi)取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類(lèi)或甲殼類(lèi)，則應先在自來(lái)水中洗刷外殼并甩干表面水分，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)外殼，按上述要求取相應部分。

6.1.3 以無(wú)菌操作取樣品25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊1min～2min，制備成1:10的樣品勻液。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽，自225mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水中取少量稀釋液加入無(wú)菌乳缽，樣品磨碎后放入500mL無(wú)菌錐形瓶，再用少量稀釋液沖洗乳缽中的殘留樣品1～2次，洗液放入錐形瓶，最后將剩余稀釋液全部放入錐形瓶，充分振蕩，制備1:10的樣品勻液。

6.2  增菌

將上述1:10樣品勻液于36℃±1℃培養18 h～24 h。

6.3  分離

6.3.1 對所有顯示生長(cháng)的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內沾取一環(huán)增菌液，于mCPC或CC平板上劃線(xiàn)分離。于39℃～40 ℃過(guò)夜培養（如果達不到39 ℃～40 ℃，則35 ℃～37 ℃）。

6.3.2 典型的創(chuàng )傷弧菌在mCPC和CC平板上呈現為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑1 mm～2 mm。

6.4  純培養

挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線(xiàn)接種3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養18 h～24 h。

6.5  初步鑒定

6.5.1 氧化酶試驗：挑選純培養的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗，創(chuàng )傷弧菌為氧化酶陽(yáng)性。

6.5.2 涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀(guān)察形態(tài)。創(chuàng )傷弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無(wú)芽胞，有鞭毛。

6.5.3 挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，轉種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養24 h觀(guān)察結果。創(chuàng )傷弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，偶爾斜面變黃。

6.5.4 嗜鹽性試驗：挑取純培養的單個(gè)可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1 ℃培養24 h，觀(guān)察液體混濁情況。創(chuàng )傷弧菌在無(wú)氯化鈉、8％氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長(cháng)或微弱生長(cháng)，在6%氯化鈉的胰胨水中生長(cháng)旺盛。

6.6  確證鑒定

取純培養物分別接種含3%氯化鈉的賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養基、MR-VP培養基，36℃±1℃培養24 h～48 h后觀(guān)察結果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養物進(jìn)行ONPG試驗�？蛇x擇生化鑒定試劑盒。創(chuàng )傷弧菌的生化性狀見(jiàn)表1，創(chuàng )傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見(jiàn)表2。

表1   創(chuàng )傷弧菌的生化性狀

表2   創(chuàng )傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別

6.7   PCR鑒定（選做）

6.7.1  DNA模板的制備

     取可疑的純菌落加入500 μL滅菌dH2O中混勻煮沸10 min，15000×g離心3 min。取上清液儲存在-20℃直至使用。也可以用商業(yè)化的DNA提取試劑盒并按其說(shuō)明提取制備DNA模板。

6.7.2  PCR擴增

6.7.2.1 引物

           擴增片段長(cháng)度：519 bp

6.7.2.2 陰性對照、陽(yáng)性對照設置

     陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應的模板；

     陽(yáng)性對照采用含有檢測序列的DNA（或質(zhì)粒）作為PCR反應的模板。

6.7.2.3 PCR反應體系

6.7.2.4 PCR反應程序

6.7.2.5 電泳

用0.5×TBE制備1.5％的瓊脂糖凝膠（含EB或Goldview0.5μg /mL，）。各取5 μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣（可包括適量上樣緩沖液），用DNA分子量標記物做參照，電壓100 V，電泳50 min（根據實(shí)驗室儀器情況確定具體電泳條件）。使用凝膠成像系統對電泳結果進(jìn)行保存和分析。

6.8  結果判定

陰性對照未出現條帶，陽(yáng)性對照出現預期大小的擴增條帶條件下，如待測樣品未出現519 bp大小的擴增條帶，則可判定該樣品檢驗結果為陰性；如待測樣品出現519 bp大小的擴增條帶，則可判定該樣品檢驗結果為陽(yáng)性。

如果陰性對照出現條帶和/或陽(yáng)性對照未出現預期大小的擴增條帶，本次待測樣品的結果無(wú)效，應重新進(jìn)行試驗，并排除污染因素。

6.9 報告

根據生化或PCR結果，報告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出創(chuàng )傷弧菌。

第二法 MPN計數法

7  操作步驟

7.1  樣品制備

   同6.1。

7.2  增菌

7.2.1 用滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內，振搖試管混勻，制備1:100的樣品勻液。

7.2.2 另取1 mL滅菌吸管，按6.2.2.1操作程序，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支1 mL無(wú)菌吸管。

7.2.3 根據對檢樣污染情況的估計，選擇3個(gè)適宜的連續稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內，培養18 h～24 h。

7.3 分離鑒定

   同定性檢測。

8  結果與報告

  根據證實(shí)為創(chuàng )傷弧菌陽(yáng)性的試管管數，查最可能數（MPN）檢索表，報告每g（mL）創(chuàng )傷弧菌的MPN值。

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