引起基因工程菌質(zhì)粒不穩定的原因

在重組菌分裂時(shí)，母細胞中的質(zhì)粒在兩個(gè)子代細胞中的分配往往是不均勻的，在極端情況下，其中一個(gè)子代細胞可能不含有質(zhì)粒。在質(zhì)粒中加入抗性標記不但能用來(lái)篩選含質(zhì)粒細胞，而且也可以用于在培養過(guò)程中防止不含質(zhì)粒細胞的大量繁殖。例如，若質(zhì)粒上已經(jīng)含有卡那霉素抗性基因，就可以在培養基中加入一定濃度的卡那霉素，這樣，不含質(zhì)粒細胞無(wú)法生長(cháng)，而含質(zhì)粒細胞的生長(cháng)不受影響。另外，在質(zhì)粒構建時(shí)應該加入稱(chēng)為 par和cer的位點(diǎn)，par位點(diǎn)能夠在細胞分裂過(guò)程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點(diǎn)則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩定性。若細胞中所含質(zhì)粒數目較少，分裂時(shí)形成不含質(zhì)粒細胞的概率就會(huì )大大增加，因此一般推薦使用高拷貝質(zhì)粒。

工程菌培養的環(huán)境對質(zhì)粒穩定性也有很大的影響，溶氧濃度、培養溫度、培養基組成及連續培養時(shí)的稀釋率等都會(huì )影響質(zhì)粒穩定性，需要進(jìn)行優(yōu)化。一般而言，適當降低菌體的生長(cháng)速率，將有利于提高重組細胞內質(zhì)粒的拷貝數，防止在細胞分裂時(shí)產(chǎn)生不含質(zhì)粒細胞。

質(zhì)粒還會(huì )形成多倍體。在細胞分裂時(shí)，多倍體在子細胞中的分配只相當于一個(gè)單倍體。因此多倍體或高聚多倍體的比例越高，不含質(zhì)粒細胞出現的概率也就越高。

其他造成宿主細胞丟失外源質(zhì)粒的因素還有很多。大量合成的外源蛋白質(zhì)會(huì )對宿主細胞的生長(cháng)產(chǎn)生危害，含質(zhì)粒細胞的生長(cháng)速度總是要比不含質(zhì)粒細胞的生長(cháng)速度低，而且所含的質(zhì)粒越多，生長(cháng)速度越慢；質(zhì)粒會(huì )形成多倍體，形成二倍體、四倍體等。雖然多倍體也能夠復制，但是多倍體的形成減少了細胞內質(zhì)粒的數目，提高了細胞分裂時(shí)產(chǎn)生不含質(zhì)粒子細胞的概率。另一類(lèi)質(zhì)粒不穩定性是由質(zhì)粒本身或宿主細胞的基因突變引起的。例如，由于基因突變，使有些質(zhì)粒中的抗性基因有可能整合到宿主細胞的染色體DNA，使宿主細胞也獲得了抗性，在這種情況下，即使在培養基中加入了抗性物質(zhì)，這類(lèi)不含質(zhì)粒細胞也能生長(cháng)。

宿主細胞的突變會(huì )引起目標蛋白質(zhì)表達的下降，特另別是當質(zhì)粒中的啟動(dòng)子受到宿主細胞所產(chǎn)生的某種蛋白質(zhì)調節時(shí)，突變可能引起該蛋白質(zhì)合成成能力的下降，使啟動(dòng)子的啟動(dòng)轉錄能力降低，目標蛋白的合成能力也就受到了影響。例如，當質(zhì)粒采用lac啟動(dòng)子時(shí)，需要加入乳糖或其類(lèi)似物IPTG誘導才能表達，細胞吸收乳糖或IPTG需要lac滲透酶的協(xié)助下才能通過(guò)細胞膜。如果宿主細胞發(fā)生突變使lac滲透酶失活舌，將造成誘導劑被拒之細胞外。這樣雖然已經(jīng)加入了誘導劑，也無(wú)法啟動(dòng)目標產(chǎn)物表達。

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